丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架材料的构建表征与细胞学体外实验研究

摘要

骨组织工程是应用生命科学和工程学的基本原理和技术，再生新的骨组织，用以修复骨组织病变或缺损。其基本思路是将特异性成骨细胞种植于具有一定生物特性的并在人体内可逐渐降解吸收的支架材料上，经体外培养形成细胞生物材料复合物，然后将复合物植入人体的骨组织缺损部位，在细胞不断增殖并分泌基质的同时，支架材料逐步降解被人体吸收，最终形成新的具有与原功能和形态相似的骨组织[1]。
　　 骨组织工程是近年来最受关注的领域之一，它在解决由于创伤、感染、肿瘤等原因所造成的骨缺损这一问题上具有很大的优势。在骨组织工程三要素:种子细胞、生长因子、支架材料中[2]，支架材料是骨组织工程的关键，它不仅将种子细胞和生长因子运送至缺损区，还给新生骨组织提供支撑作用。目前，支架材料是骨组织工程中的研究热点，尤其是复合支架材料。丝素蛋白和壳聚糖都是天然高分子材料，具有良好的生物特性及独特的机械特性，成为近年来较热门的组织工程学材料。
　　 本试验将一定浓度的丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液以不同质量比例相混合，通过数次冷冻干燥合并化学交联的方法制备出具有一定强度的多孔性支架，对其微观结构及相关的性能进行初步研究，筛选出适合成骨细胞生长的理想支架材料，为今后的骨缺损修复改建打下实验基础。
　　 第一部分丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架材料的构建及结构表征的研究
　　 目的：
　　 通过冷冻干燥合并化学交联的方法，制备出各种不同组分的丝素蛋白及壳聚糖的复合支架材料，对其材料结构表征进行分析。
　　 方法：
　　 通过CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1:2∶8（摩尔比）溶解体系溶解、过滤、浓缩提纯制备出浓度为2％的丝素蛋白溶液，壳聚糖溶解于乙酸溶液配制成3％壳聚糖溶液，将二者溶液按不同质量比混匀后，经数次冷冻干燥以及浸泡交联后，制得成品支架材料，采用电镜观察形貌，计算孔隙率并对支架的内部结构进行红外光谱分析(FTIR)、X射线衍射表征(XRD)、EDS电子能谱分析。
　　 结果：
　　 丝素蛋白/壳聚糖(SF/CS)内部为三维多孔支架，尤以40％丝素蛋白-60％壳聚糖(40％SF-60％CS)组支架材料，以其适合成骨细胞直径的孔径大小有望成为骨组织工程中的优良支架材料，且孔隙率保持在90％以上。本实验也通过红外图谱分析、X射线衍射分析和能谱分析，阐释了二者混合后内部结构的变化，证实了二者互为改性的试验方法是稳定且成功的。
　　 第二部分丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架材料的理化性能及降解试验的研究
　　 目的：
　　 对不同组分配比的SF/CS支架材料的吸水率、溶胀率进行研究，筛选出最佳配比的组分，然后进行该最佳组分的降解试验，观察是否具有良好的降解率以适应生物材料在体内的降解时间，以及降解液的pH值范围是否适合体内进行新陈代谢活动。
　　 方法：
　　 制备出各个不同组分支架材料（同第一部分），通过固态支架材料浸入水中所吸收水的重量对其浸水前实测重量的百分率计算吸水率，而将固态的支架材料浸入水等溶剂液体时，湿态较其干态的体积变化的比率计算溶胀率。综合以上试验结果，得到最优配比组为40％SF-60％CS组。将其置入人工体液(SBF)，进行为期64天的降解试验，检测丝素蛋白/壳聚糖(SF/CS)支架材料的降解速率以及降解液pH值的变化。
　　 结果：
　　 各组质量配比的丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料均具有良好的吸水率，统计学分析发现组间差异不显著(P＞0.05)，但溶胀率随着丝素蛋白含量的增多而减小，在纯壳聚糖组，溶胀率接近80％，与其他各组有显著区别(P＜0.05），而20％SF-80％CS组和40％SF-60％CS组的溶胀率略高于60％SF-40％CS组和80％SF-20％CS组，差异有统计学意义（P＜0.05），但20％SF-80％CS组和40％SF-60％CS组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 综合以上各项实验结果，筛选出40％SF-60％CS组支架材料为最优组合，在本实验中对40％SF-60％CS组也进行了为期为64天的体外降解试验，发现降解速率相对比较平稳，最初的前15天里，降解速率很快，支架材料失去了14.43％的原始重量，而在接下去的21天里，降解速率开始减慢，而在以后的28天里，降解速率变得更慢，直到64天时，支架材料仅失去了18.25％的原始重量。然而降解液pH值在长达2个月的降解时间里，一直在7.42～7.62这一狭小的范围内波动，接近中性，这与体内微环境的pH值相适应，以上试验结果表明该支架材料可用于在生物体内。
　　 第三部分丝素蛋白/壳聚糖三维多孔支架材料的生物相容性及成骨性能的细胞学实验研究
　　 目的：
　　 在体外实验中，探讨40％SF-60％CS组支架材料与成骨细胞MG-63的生物相容性以及对MG-63细胞的成骨功能影响。
　　 方法：
　　 实验分组:因为纯丝素蛋白(100％SF)支架材料松脆，水溶液中溶失特别高，不能在水溶液中稳定存在，故实验组只设为:纯CS组(100％CS)和40％SF-60％CS组，而空白对照组:载玻片组。
　　 将对数生长期的成骨细胞MG-63接种于各组材料上后，通过Hoechst荧光染色观察其在材料上的生长情况，计算黏附率和增殖率，最后通过MG-63细胞分泌碱性磷酸酶(ALP)的活性及矿化结节的形成来研究支架材料的成骨性能。采用SPSS16.0统计分析软件做统计学分析，统计学方法采用析因方差分析，为了对每一时间段组间进行比较，采用One-WayANOVA方差分析，以P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 MG-63细胞在支架上的生长情况良好，接种6小时后，可见细胞已经开始黏附于支架材料的壁上，接种24小时后，大部分细胞黏附完毕，3天后，各细胞之间联合紧密，支架材料孔壁及孔隙内已长满细胞。
　　 早期黏附率结果为，两组实验组均显著优于空白对照组载玻片组(P＜0.05)，在1h，3h，6h这三个时间点里，材料上的细胞数目是逐渐增多的，在1h和3h这两个时间点，两组实验组差异具有统计学意义(P＜0.05)，而在6h时，两组黏附率均接近75％，差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 两组实验组支架上的MG-63细胞增殖率显著高于空白对照组载玻片组。在第1天和第5天时，两组实验组差异均无统计学意义(P＞0.05)。而在第3天时，两组实验组差异具有统计学意义(P＜0.05)
　　 两组实验组材料对MG-63细胞分泌碱性磷酸酶均有促进作用，与空白对照组相比差异具有显著性意义(P＜0.05)。两组实验组相比较，发现支架材料与MG-63共培养的7d，14d，21d里，差异均有显著性（P＜0.05），其中40％SF-60％CS组优于100％CS组。
　　 Hoechst染色结果表明MG-63细胞在40％SF-60％CS组支架材料上具有良好的活性，且具有一定的增殖能力。而在矿化研究中也发现，无论是细胞团聚还是基质分泌以及最后的钙化结节形成，40％SF-60％CS组支架材料均优于100％CS组支架材料。
　　 全文结论：
　　 1.将浓度为2％丝素蛋白溶液与3％壳聚糖溶液相混合，互为改性，冷冻干燥后能制备出各组不同组分的支架材料，通过红外分析和xrd分析结果也印证了共混后材料结构的微观性能发生改变，使其不稳定的α螺旋/无规卷曲结构向较为稳定的β-折叠结构转变，且结晶程度也增强。其中40％SF-60％CS组，具有适合成骨细胞生长的较佳孔径，且结构稳定，而成为细胞支架的首选配比。
　　 2.各组丝素蛋白/壳聚糖复合支架材料均具有良好的吸水率，但溶胀率随着丝素蛋白含量的增多而减小，综合以上各条件，也筛选出40％SF-60％CS组为最优组合，对该组进行64天的体外降解试验，发现降解速率相对比较平稳，降解液pH值接近中性。这与体内微环境的pH值相适应，这利于该支架材料在生物体内利用。
　　 3.40％SF-60％CS组支架材料有利于MG-63细胞的早期黏附、生长、增殖，这说明经过改性的40％SF-60％CS组支架材料有良好的生物相容性以及较佳的细胞亲和力，并且可以促进成骨细胞较旺盛的分泌细胞基质，是一种较好的骨组织工程材料，对将来能用于骨组织工程的研究打下基础。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 骨组织工程概述

1．2 骨组织工程支架材料

1．2．1 支架材料所需满足的条件

1．2．2 复合支架材料的分类

1．3 丝素蛋白和壳聚糖

1．3．1 丝素蛋白

1．3．2 壳聚糖

1．4 丝素蛋白，壳聚糖在骨组织工程学中的研究进展

1．5 本论文的研究内容

第二章 丝素蛋白／壳聚糖三维多孔支架材料的构建及结构表征的研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料、试剂和仪器

2．2．2 SF／CS支架材料的制备

2．2．3 材料结构及形貌观察

2．2．4 电镜观察

2．2．5 孔隙率测试

2．2．6 红外分析

2．2．7 X射线衍射分析

2．2．8 电子能谱分析

2．2．9 统计分析

2．3 结果

2．3．1 宏观形态

2．3．2 电镜观察

2．3．3 孔隙率测试

2．3．4 红外分析

2．3．5 X射线衍射分析

2．3．6 电子能谱分析

2．4 讨论

2．4．1 支架材料的制备方法

2．4．2 优良的孔隙率

2．4．3 支架结构表征分析

2．5 本章小结

第三章 丝素蛋白／壳聚糖三维多孔支架材料理化性能及降解试验的研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料、试剂和仪器

3．2．2 样品制备及试剂配制

3．2．3 吸水率

3．2．4 溶胀率

3．2．5 降解性能试验

3．2．6 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 支架材料理化性能的检测

3．3．2 降解性能试验

3．4 讨论

3．5 本章小结

第四章 丝素蛋白／壳聚糖三维多孔支架材料生物相容性及成骨性能的研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料、试剂和仪器

4．2．2 样品制备及实验分组

4．2．3 成骨细胞MG-63的培养

4．2．4 MG-63在实验组支架材料上的生长状况及形态学观察

4．2．5 MG-63与支架材料的生物相容性检测

4．2．6 MG-63与支架材料的细胞活性检测

4．2．7 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 MG63细胞在培养瓶的生长情况

4．3．2 MG-63细胞在支架上的生长情况

4．3．3 细胞黏附率情况

4．3．4 Hoechst染色结果

4．3．5 细胞增殖情况

4．3．6 碱性磷酸酶活性测定

4．3．7 形成钙化结节能力的观察结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

第五章 结论

参考文献

中英文缩略词表

成果

致谢

声明

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