CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究

摘要

[目的]
　　 1、建立DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记方法，并观察99mTc标记物在体内、外的稳定性及其在正常小鼠体内的分布。
　　 2、评价生物素化CD45单抗及99mTc标记生物素在人Raji细胞移植瘤裸鼠模型中三步法预定位放免显像价值。
　　 [材料与方法]
　　 1DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究
　　 1.1、实验动物
　　 4-6周龄昆明种小白鼠24只（雌雄不限），质量19-21g，由南方医科大学实验动物中心提供。
　　 1.2、99mT标记DTPA-生物素
　　 99mTc标记DTPA-生物素采用直接标记法，纸层析法测定其标记率，固定相为新华1号虑纸，展开剂为丙酮和生理盐水，分别在标记后0h、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定放化纯度。
　　 1.3、99mTc标记hIgG
　　 99mTc标记hIgG采用巯基乙醇直接还原法，纸层析法测定其标记率，固定相为新华1号滤纸，展开剂为30％氨水∶乙醇∶水(1:2∶5)和生理盐水，分别在标记后0h、1h、3h、6h、12h采用纸层析法测定标记率及放化纯度。
　　 1.4、99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的体外稳定性实验
　　 分别取500μl的99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG溶液，加入1ml的生理盐水(NS)中，放置37℃温育箱中温育至12h，分别于1h、3h、6h、12h取样，用纸层析法测定放化纯度。
　　 1.5、99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG在正常小鼠体内的生物分布及显像
　　 取24只昆明种小白鼠，随机分为2组，每组12只小鼠，第一组为静脉注射99mTc-DTPA-生物素组，第二组为静脉注射99mTc-hIgG组。每组于尾静脉注射7.4MBq/100μl的99mTc标记物后1h、3h、6h和12h各取3只小鼠分别进行体外SPECT显像，于显像后断颈处死，取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼及血液，称重后在放射免疫γ计数器中测量放射性计数，经放射性衰变校正后计算各脏器的每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
　　 2、CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究
　　 2.1、Raji细胞株
　　 Raji细胞株由南方医科大学南方医院血液科提供。用RPMI1640培养液培养，加入10％胎牛血清，在37℃和5％CO2和95％相对湿度的孵箱内孵育。
　　 2.2、流式细胞仪检测Raji细胞CD45表达
　　 收集对数期生长的Raji细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，分管，106/管，加入CD45单抗，同型IgG1作为阴性对照抗体，4℃孵育30min，PBS洗涤，用流式细胞仪分析样本中阳性细胞数，计算荧光标记阳性细胞的百分率。
　　 2.3、建立淋巴瘤实验动物模型
　　 (1)4-6周龄裸鼠24只（雌雄不限），质量18-22g，由广东省实验动物中心和南方医科大学实验动物中心提供。
　　 (2)收集对数期生长的的Raji淋巴瘤细胞株并离心，生理盐水制成悬浮液(＞1×108/mL)，每只裸鼠双侧臀部皮下注入0.2ml，无特定病原体（SPF级）环境下饲养，待肿瘤细胞种植于裸鼠臀部皮下后，记录肿瘤成瘤时间，成瘤后每2天用游标卡尺测量肿瘤最长径a和最短径b。
　　 2.4、生物素化CD45单抗的制备
　　 取2mgCD45单抗，按CD45单抗∶生物素酯（摩尔比）=1:30-1:50取样，在0.1MPH8.5碳酸氢钠溶液中反应(1ml)，室温下用玻璃棒轻轻搅拌1小时，将反应液注入PD-10层析柱内，放入离心器中（3000转/min×2次）离心层析。
　　 2.5、采用HABA/Avidin试剂进行抗体CD45生物素化程度测定
　　 取收集的生物素化CD45单抗100μl，加入900ul的HABA/Avidin试剂中进行反应。由于游离的生物素与HABA/Avidin发生反应约1分钟后，当反应体系的颜色由橙红色转为淡黄色时，测量其500nm的OD值。抗体生物素化程度的计算（根据HABA/Avidin试剂说明书）
　　 2.6、99mTc标记生物素及99mTc标记CD45单抗
　　 参见标记部分。
　　 2.7、淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位体内生物分布测定
　　 取人Raji细胞移植瘤裸鼠12只，每个时间点3只裸鼠，尾静脉注射生物素化CD45单抗100μg/100μL，48h后尾静脉注射亲和素(Avidin)200μg/100μL，再过48h尾静脉注射99mTc-DTPA-生物素7.4MBq(20μg/100μl)，注药后1h、3h、6h、12h断颈处死裸鼠后，取肝、脾、肾、肺、胃、肠、肌肉、骨骼、血液及肿瘤，称重后在γ计数仪中测量放射性计数，经放射性衰变校正后计算各脏器的％ID/g及肿瘤/非肿瘤(T/NT)比值。
　　 2.8、淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像
　　 取淋巴瘤荷瘤裸鼠6只，随机分为2组，每组3只。实验组为三步法预定位放免显像组，具体给药时间及方法同上述生物分布实验;对照组为99mTc标记CD45单抗放免显像组，静脉注射99mTc-CD45单抗100μg/100μL，分别于注药后3h、6h、12h进行SPECT显像。上述两组裸鼠于12h的SPECT显像结束后，处死所有裸鼠，分离各脏器，称重并测量放射性计数，经放射性衰变校正后计算各脏器的％ID/g和T/NT比值，并进行对比。
　　 2.9、统计学分析
　　 全部实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析处理，定量参数（12h的T/B、12h的T/M）用均数±标准差（(—X)±S）表示，两样本比较采用独立样本t检验，P＜0.05有显著性差异。
　　 [结果]
　　 1、DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究
　　 1.1、99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的标记率及放化纯度测定
　　 用纸层析法测定99mTc标记DTPA-生物素的标记率＞80％，99mTc标记hIgG的标记率＞70％，经PD-10层析柱分离纯化后99mTc-hIgG的放化纯度＞90％。
　　 1.2、99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG的体外稳定性测定
　　 99mTc-DTPA-生物素在NS中温育12h均处于较稳定状态，放化纯度均＞75％;99mTc-hIgG在NS中温育12h均处于稳定状态，放化纯度均＞85％。
　　 1.3、99mTc-DTPA-生物素和99mTc-hIgG在小鼠体内的SPECT显像
　　 (1)99mTc-DTPA-生物素在注药后1h、3h、6h、12h小鼠SPECT显像结果显示，99mTc-DTPA-生物素在肾内摄取高，提示主要经泌尿系统排泄，血液及肌肉放射性分布较少，影像较淡。
　　 (2)99mTc-hIgG在注药后1h、3h、6h、12h小鼠SPECT显像结果显示，小鼠肝脏和脾脏内见明显放射性聚集，12h内血池见较多放射性分布，而肠道、肌肉、骨骼内放射性分布较少。
　　 2、CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究
　　 2.1、Raji细胞CD45表达及Raji细胞移植瘤裸鼠模型构建
　　 流式细胞仪测得Raji细胞CD45表达率为78.5％。24只裸鼠有16只成瘤，移植瘤成活率为67％。
　　 2.2、生物素化CD45单抗的生物素化程度测定
　　 平均每个CD45单抗结合12个生物素分子
　　 2.3、99mTc-CD45单抗在淋巴瘤裸鼠模型中的放射免疫显像研究
　　 静脉注射99mTc-CD45单抗后3h、6h、12h荷瘤裸鼠SPECT显像示:肝脏、脾脏及肾脏内见明显放射性聚集，12h血池内见较多放射性分布，12h肿瘤部位见有少量放射性集聚，12h肿瘤的％ID/g为0.89±0.13，肿瘤/血液比值为1.6，肿瘤/肌肉比值达到2.5。
　　 2.4、淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像及生物分布研究
　　 三步法给药后1h、3h、6h、12h荷瘤裸鼠SPECT显像示:整个显像期间血池内放射性均较低，肝脏和脾脏内见较多放射性浓聚;注射标记物1h后，移植肿瘤隐约显影，随着时间的延长，肿瘤内放射性浓聚逐渐增多，3-6h肿瘤显影清晰，并持续到12h。注药后3h、6h和12h肿瘤的％ID/g分别为1.73±0.22、1.24±0.03和0.94±0.07;肿瘤/血液比值分别为3.5、4.9和7.8;肿瘤/肌肉比值分别为到8.2、8.9和10.4。
　　 [结论]
　　 1、99mTc标记DTPA-生物素和hIgG的标记率分别＞80％和＞70％，99mTc标记标记hIgG的放化纯度＞90％，具有良好的体外稳定性，小鼠体内的生物分布实验表明，99mTc-生物素和99mTc-hIgG在体内的血清除速率及生物学分布明显不同，为进一步的预定位放免显像研究中亲和素-生物素系统的不同组分的选择提供实验数据。
　　 2、与99mTc直接标记CD45单抗相比较，99mTc-DTPA-生物素三步法预定位技术在CD45单抗淋巴瘤裸鼠模型放射免疫显像中的应用，显著改善肿瘤的T/NT比值，标记物注射后1h肿瘤即可见显影，3h肿瘤显影清晰，从而达到肿瘤早期显像的目的。上述研究成果为下一步开展CD45单抗三步法预定位放免治疗裸鼠淋巴瘤移植瘤的研究提供实验依据。

目录

摘要

前言

第一部分 DTPA-生物素和hIgG的99mTc标记及其在正常小鼠体内生物分布研究

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

第二部分 CD45单抗介导的淋巴瘤荷瘤裸鼠三步法预定位放免显像研究

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

全文总结

参考文献

综述

中英文缩略语对照表

在读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明