羟基红花黄色素A抗兴奋毒性神经元死亡的神经保护作用

摘要

目的：
　　 1.探讨谷氨酸(Glu)兴奋毒性损伤后，羟基红花黄色素A(HSYA)对器官型脑片海马齿状回(HDG)神经发生的影响。
　　 2.研究Glu兴奋毒性损伤后，HSYA对器官型海马脑片神经细胞死亡的影响，以及保护线粒体功能的机制。
　　 3.探讨Glu兴奋毒性损伤后，HSYA对大鼠皮层神经细胞凋亡的影响，以及对p38MAPK途径诱导凋亡的作用。
　　 方法：
　　 1.制备出生后6天SD乳鼠器官型海马脑片，按随机数字表法分为4组（每组6张脑片）:(1)生理盐水对照组(3.5mMGlu+1ml生理盐水干预，CG);(2)空白对照组(正常培养，不造模+不干预，Nor);(3)大剂量HSYA组(3.5mMGlu+1ml0.072mg/mlHSYA干预，HG1);(4)小剂量HSYA组(3.5mMGlu+1ml0.036mg/mlHSYA干预，HG2)。建立Glu损伤模型，造模前及造模后1d、3d和6d通过倒置显微镜及免疫荧光染色观察脑片生长情况，按常规方法分别进行BrdU与Nestin免疫荧光双标染色。计数HDG中神经干细胞(Neuralstemcells，NSCs)并进行重复测量的方差分析，每个时间点各组之间的比较采用单因素方差分析，各组内不同时间之间的比较采用重复测量的方差分析，主效应不同水平间的多重比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 2.制备出生后6天SD乳鼠器官型海马脑片，按随机数字表法分为5组（每组5张脑片）:(1)正常对照组（正常培养基培养，Nor）;(2)大剂量HSYA干预组（3.5mMGlu+1ml0.072mg/mlHSYA干预，HG1）;(3)小剂量HSYA干预组（3.5mMGlu+1ml0.036mg/mlHSYA干预，HG2）;(4)生理盐水对照组(3.5mMGlu+1ml生理盐水干预，CG);(5)大剂量HSYA对照组(1ml0.072mg/mlHSYA干预，Only)。建立Glu损伤模型，加入含有不同浓度HSYA的培养基(0.072mg/ml，0.036mg/ml)孵化72小时，加入HSYA前、24和48小时后分别测量PI摄取量。蛋白免疫印迹分析5-LO，caspase-3，SOD2，P-Akt蛋白表达水平。各组之间PI荧光值，5-LO，caspase-3，SOD2，P-Akt蛋白表达量的比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，方差齐时组内两两多重比较采用LSD法，方差不齐时组内两两多重比较采用Tamhane'sT2法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 3.用胚胎18天(E18)SD大鼠制备前额叶皮层神经元的原代培养，在体外培养10至14天后建立Glu损伤模型。按随机数字表法将神经细胞分为5组（每组5孔）:(1)正常对照组（正常培养基培养，Nor）;(2)大剂量HSYA干预组（3.5mMGlu+0.072mg/mlHSYA干预，HG1）;(3)小剂量HSYA干预组（3.5mMGlu+0.036mg/mlHSYA干预，HG2）;(4)生理盐水对照组(3.5mMGlu+生理盐水干预，CG);(5)大剂量HSYA对照组（0.072mg/mlHSYA干预，Only）。MTT法，Hoechst33258/PI双染，流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染法)检测神经细胞死亡和凋亡。RT-PCR法检测caspase-3、ATF2、p38MAPK、MAPKKK的表达。不同组别之间神经细胞凋亡的比较、RT-PCR相对密度的比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组内两两多重比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.低倍镜下(40×)正常脑片呈褐色，颜色均匀，透光性良好，可清晰分辨皮层、海马（CA1-4及DG区）、脑室、皮层下核团，白质纤维束等结构。高倍镜下(200×)可见胞质和胞核。Glu损伤前后不同时间点之间NSCs(BrdU+，Nestin+)的差异有统计学意义(F=228.075，P＜0.001)，HG1，HG2，CG及Nor均如此，F值分别为31.537，181.762，248.345和52.444，均P＜0.001。各组之间神经干细胞数的差异有统计学意义(F=947.077，P＜0.001);从各时间点看，除Glu损伤前，各时间点神经干细胞数均存在下列关系:Nor＞HG1＞HG2＞CG（均P＜0.001）。Glu损伤前后与不同组别之间存在交互效应(F=123.639，P＜0.001)。
　　 2.3.5mMGlu损伤后24和48小时主要导致海马DG区递增性细胞死亡。Glu损伤24h后各组之间PI荧光值的差异有统计学意义(F=11.305，P=0.002);HG1＜CG，HG1＜HG2，差异有统计学意义（均P＜0.05）。Glu损伤48h后各组之间PI荧光值的差异有统计学意义(F=11.731，P=0.002);HG1＜CG，HG2＜CG，HG1＜HG2，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间5-LO的差异有统计学意义(F=46.702，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间caspase-3的差异有统计学意义(F=19.419，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间SOD2的差异有统计学意义(F=15.483，P=0.000);Nor＞HG1，Nor＞HG2，Nor＞CG，HG1＞CG，HG2＞CG，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间P-Akt的差异有统计学意义(F=23.299，P=0.000);Nor＞HG2，Nor＞CG，HG1＞CG,HG1＞HG2，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
　　 3.MTT法测得各组之间细胞存活率的差异有统计学意义(F=17.063，P=0.000);Nor＜HG1，Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，差异有统计学意义（均P＜0.05）。Hoechst33258和PI双染，HG1、HG2、CG三组呈弱蓝色荧光细胞依次减少，呈强蓝色及弱红色双染细胞依次增多，呈强红色及弱蓝色的坏死细胞也依次增多。各组之间凋亡细胞率的差异有统计学意义(F=29.965,P=0.000);Nor＜HG1,Nor＜HG2,Nor＜CG,HG1＜CG,HG2＜CG,差异有统计学意义（均P＜0.05）。流式细胞分析:各组之间早期凋亡细胞率的差异有统计学意义(F=55.089，P=0.000);Nor＜HG1，Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG,HG2＜CG，HG1＜HG2，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间晚期凋亡细胞率的差异有统计学意义(F=13.519，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG,HG1＜HG2，差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间坏死率的差异有统计学意义(F=26.957,P=0.000);Nor＜HG1,Nor＜HG2,Nor＜CG,HG1＜CG,HG2＜CG,差异有统计学意义（均P＜0.05）。RT-PCR结果:各组之间caspase-3的差异有统计学意义(F=39.237，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG,HG1＜CG,HG2＜CG,差异有统计学意义（均P＜0.05）。各组之间ATF2的差异有统计学意义(F=53.137，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，差异有统计学意义(均P＜0.05)。各组之间P38MAPK的差异有统计学意义(F=23.645，P=0.000);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG2＜CG，HG1＜HG2，差异有统计学意义(均P＜0.05)。各组之间MAPKKK的差异有统计学意义(F=10.174，P=0.001);Nor＜HG2，Nor＜CG，HG1＜CG，HG1＜HG2，差异有统计学意义（均P＜0.05）。
　　 结论：
　　 1.0.072mg/mlHSYA减轻Glu兴奋毒性对NSCs的损伤，促进NSCs再生。
　　 2.0.072mg/mlHSYA减少Glu造成的神经元死亡，这种保护作用24h出现，可持续至48h。Glu兴奋性损伤导致神经元线粒体功能障碍，0.072mg/mlHSYA通过降低5-LO和caspase-3，升高SOD2和磷酸化Akt的蛋白表达，保护线粒体功能，减少神经细胞死亡。
　　 3.HSYA主要是通过抑制Glu诱导的细胞凋亡来保护神经细胞。0.072mg/mlHSYA作用于p38MAPK通路的上游激活物MAPKKK，核心蛋白激酶p38MAPK，下游转录因子ATF2，以及最后的效应蛋白caspase-3多个位点，下调其基因表达，抑制神经元的凋亡。

目录

摘要

第一章 羟基红花黄色素A对大鼠器官型海马脑片谷氨酸损伤模型神经发生的影响

前言

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

参考文献

第二章 羟基红花黄色素A对大鼠器官型海马脑片谷氨酸损伤模型神经细胞死亡的影响

前言

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

参考文献

第三章 羟基红花黄色素A对谷氨酸诱导的神经细胞凋亡的影响

前言

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

参考文献

全文小结

综述

攻读学位期间成果

缩略语

致谢

声明

统计学证明