下调N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V增强人鼻咽癌细胞CNE-2放射敏感性

摘要

一、研究背景
　　 鼻咽癌作为一种上皮来源的肿瘤，在东南亚尤其是我国华南地区发病率极高，达15-50/100.000。放射治疗是其最主要的治疗手段。然而，很多病人发生了放射抵抗性，一些病人往往在放疗后1.5年内就发生了局部复发或远处转移。目前研究表明，某些分子，比如gp96，GDF15与AT1R对鼻咽癌细胞放射敏感性有着重要作用。
　　 蛋白的糖基化是最重要的翻译后修饰，其影响细胞生长，分化和肿瘤转移。位于高尔基体内的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶对蛋白糖基化起着至关重要的作用。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶至少有6种，分别为GnT-Ⅰ-Ⅵ。其中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅴ(N-acetylglucosaminyltransferase(Ⅴ),GnT-Ⅴ)是公认的糖基转移酶家族的主要成员。研究发现，GnT-Ⅴ催化形成的β1,6葡萄糖N-糖链分支，是细胞恶性转化相关的关键结构。其通过不同的方式，如促进细胞增殖和抑制细胞凋亡参与此过程。目前的研究表明，下调N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅴ有利于全反式维甲酸诱导的人肝癌细胞凋亡;然而，在神经母细胞瘤细胞中，GnT-Ⅴ的抑制导致维甲酸诱导的细胞凋亡。以上的研究表明在不同的肿瘤细胞中，GnT-Ⅴ扮演着不同的角色。
　　 虽然已有的研究表明，GnT-Ⅴ在肿瘤的恶性潜能中起着重要作用。目前为止尚未有文献报道关于GnT-Ⅴ基因对鼻咽癌放射敏感性影响方面的研究。在本实验中，我们利用干扰RNA技术，下调鼻咽癌细胞CNE-2中GnT-Ⅴ的表达量，得到了低表达GnT-Ⅴ的细胞株CNE-2GnT-Ⅴ/2224。分别在体外和体内水平，通过对鼻咽癌细胞CNE-2和低表达GnT-Ⅴ的鼻咽癌细胞CNE-2的放射敏感性比较，从而探索GnT-Ⅴ和鼻咽癌细胞放射敏感性的关系，同时还进一步探讨其潜在的机制。
　　 二、研究目的
　　 利用RNA干扰技术，下调鼻咽癌细胞CNE-2中GnT-Ⅴ的表达量，在体外及体内水平观察GnT-Ⅴ对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响及其潜在的机制，为鼻咽癌放射治疗联合分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供理论依据。
　　 三、实验方法
　　 1、pGPU6/GFP/NeoGnT-ⅤshRNA质粒的构建及鉴定已由本课题组成员完成。pGPU6/GFP/NeoGnT-Ⅴ/1564和pGPU6/GFP/NeoGnT-Ⅴ/2224为靶向抑制GnT-Ⅴ表达的质粒;pGPU6/GFP/NeoGnT-Ⅴ/NC为对照质粒。
　　 2、细胞培养和转染
　　 人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2培养于37℃5％CO2条件下，含10％新生牛血清的RPMI-1640中，每周传代2～3次。细胞培养至对数生长期，用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入CNE-2细胞。利用G418筛选转染成功的细胞。转染成功的人鼻咽癌细胞株培养于含10％新生牛血清及2000ug/mlG418的RPMI-1640中。
　　 3、pGPU6/GFP/NeoGnT-ⅤshRNA干扰效果检测
　　 a.qRT-PCR测定GnT-ⅤmRNA
　　 用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA，采用AMV逆转录合成cDNA.GnT-Ⅴ上游引物为5'AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3'，下游引物为5'TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT3'。合成cDNA的反应条件为:15分钟37℃，5秒85℃。PCR的反应条件为:预变性95℃30秒，PCR反应95℃5s，60℃20s(40个循环)，溶解曲线分析95℃0秒，65℃15秒，95℃0秒。计算出2-△△ct，代表每组mRNA的相对表达量。每组重复例数为3。
　　 b.Westernblot检测GnT-Ⅴ蛋白表达
　　 分别收集各组细胞，用预冷的的PBS洗涤，加入RIPA裂解缓冲液中提取细胞蛋白，并用标准BCA法测得蛋白总浓度。每个蛋白样品（20微克/孔），用上样缓冲液匀浆后，煮沸5分钟，然后在8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并采用半干转移装置转移到PVDF膜上。提取总蛋白，测定蛋白浓度，吸取总蛋白，去离子水补至20μL，加入上样buffer煮沸5min，离心后吸取25μL上样，经不连续SDS-PAGE电泳分离后，用半干法电转移至PVDF膜上，5％的非脂肪奶粉封闭2小时，TBST洗膜后用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗体(1:200)、兔抗人β-actin蛋白单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜，洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG(1:6000)，羊抗兔IgG(1:6000)，室温下摇动1h，洗膜后用ECL化学发光系统检测，暗室曝光X线片，冲洗胶片，UVI凝胶成像系统摄像，QuantityOne软件分析条带灰度值，用GnT-Ⅴ/β-actin代表GnT-Ⅴ的相对表达量。每组重复例数为3。
　　 4、平板克隆形成实验观察下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞放射敏感性的影响
　　 取对数生长期的待测细胞倍比稀释，每个6孔板接种200个细胞，24小时细胞贴壁后接受X线照射(0，2，4，6，8Gy)。2周后计算形成的克隆数，通过克隆数计算出细胞生存分数。实验分为CNE-2组、CNE-2GnT-Ⅴ/NC组和CNE-2GnT-Ⅴ/2224组，每组重复例数为18。
　　 5、CCK-8检测下调GnT-Ⅴ表达后对CNE-2细胞增殖能力的影响取对数生长期的待测细胞，分别接种于96孔板中，接受X线照射(0，2，4，6，8Gy)后。CCK-8法测量不同细胞及剂量组的OD450nm值。实验分为CNE-2组，CNE-2GnT-Ⅴ/NC组，CNE-2GnT-Ⅴ/1564组与CNE-2GnT-Ⅴ/2224组，每组重复例数为18。细胞放射存活率=（放射组OD450值/未放射组OD450值）×100％。
　　 6、细胞凋亡的检测
　　 (1)、细胞培养至对数生长期后，常规胰酶消化，用PBS洗涤细胞2次，集105个细胞。在50μL的BindingBuffer中加入5μL7-AAD染液，混匀。在收集细胞中加入上述7-AAD染液，混匀;室温、避光、反应5～15min。反应后再加入450μL的BindingBuffer混匀。加入1μLAnnexin(V)-PE混匀;室温、避光、反应5～15min。用流式细胞仪检测细胞凋亡。每组重复例数为3。
　　 (2)、Caspase-3活性检测
　　 取对数生长期的待测细胞，分别接种于96孔板中，接受X线照射24小时后用裂解缓冲液处理细胞。加入pNA标记的蛋白酶底物多肽AC-DEVE-PNA(caspase-3的底物)37℃孵育2小时。在分光光度计在405nm处测量吸光度。结果以实验组光密度值与对照组光密度值的百分比表示。每组重复例数为18。
　　 7、流式细胞术测细胞周期
　　 细胞培养至对数生长期后，常规胰酶消化，PBS洗3次，制成单细胞悬液，并调整细胞浓度至106个/ml。加入3ml预冷PBS重悬细胞，800rpm×5min，吸净上清。.加入500ulPBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，加入预冷的75％乙醇(-20℃)。.取出固定的样品，800rpm×5min离心，弃上清。加入3ml预冷PBS重悬细胞和PI工作液，4℃避光染色30分钟。转至流式检测管，上机检测细胞周期。每组重复例数为3。
　　 8、裸鼠皮下成瘤和分次放射实验
　　 选用4-6周龄BALB/c雄性裸鼠，饲养于无菌环境中。36只裸鼠随机分为CNE-2、CNE-2GnT-Ⅴ/NC、CNE-2GnT-Ⅴ/22243组。细胞重悬于RPMI-1640，调整细胞浓度为5×107个/ml，取对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×107个/mL，按100μL/只进行左臀部皮下注射。待裸鼠成瘤体积达到300mm3后，每组随机分为放射组（6只）和非放射组（6只）。放射组每隔1天照射剂量2Gy，总放射剂量为10Gy。每隔2天测量瘤体的体积，观察瘤体体积大小变化。瘤体体积=短径2×长径/2。
　　 9、Westernblot检测皮下成瘤Bcl-2、Bcl-x(l)、Bax表达
　　 将瘤体组织用眼科剪剪碎后，置于研磨器内研磨。待组织加入蛋白裂解液中裂解，离心后取上清，-70℃保存。其余步骤同GnT-Ⅴ蛋白检测过程。其中Bcl-2、Bax—抗稀释浓度为1:200;Bcl-xl稀释浓度为1:300。二抗稀释浓度均为1:6000。
　　 10、免疫组化
　　 石蜡切片脱蜡和水化后，对组织抗原进行相应的修复。切片加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10分钟，加入动物非免疫血清（兔/鼠），室温下孵育20分钟。除去血清，每张切片加一滴一抗(GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗体(1:200)、Bcl-x(l)单克隆抗体(1:200)、Bcl-2单克隆抗体(1:300)，室温下孵育60分钟。切片加生物素标记的兔抗羊IgG，室温下孵育10分钟。除去PBS液，每张切片加链霉菌抗生素蛋白—过氧化酶，室温下孵育10分钟。冲洗后滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察。自来水冲洗，苏木素复染。
　　 10、统计学分析
　　 实验结果均经SPSS13.0软件统计。计量资料统计分析结果用((X)±SD)表示。qRT-PCR、GnT-Ⅴ蛋白的Westernblot结果多组比较采用完全随机设计的方差分析，多重比较采用LSD法。平板克隆实验、CCK-8实验、流式细胞术测细胞周期及凋亡、capase-3活性检测、裸鼠皮下成瘤及分次照射实验、凋亡BCl-2家族蛋白的Westernblot检测采用析因设计的方差分析。参数比较均先进行方差齐性检验，若方差不齐，用基于方差不齐的近似F检验(Welch)其多重比较采用Dunnett'sT3法;P＜0.05代表有统计学差异。
　　 四、结果
　　 1、重组质粒的稳定转染
　　 质粒pGPU6/GFP/Neo中含有编码GFP的基因，故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。在荧光显微镜下观察，细胞均发绿色荧光，说明稳定转染成功。
　　 2、干扰效果分析
　　 GnT-ⅤshRNA表达质粒对GnT-ⅤmRNA和蛋白表达的影响:qRT-PCR测量四组细胞中GnT-ⅤmRNA的表达。CNE-2GnT-Ⅴ/2224和CNE-2GnT-Ⅴ/1564的mRNA的表达水平降低了(71.91±2.83)％和(63.47±4.45)％。Westernblot检测四组细胞中GnT-Ⅴ蛋白的表达。CNE-2GnT-Ⅴ/2224和CNE-2GnT-Ⅴ/1564蛋白的表达水平分别降低了(66.33±4.51)％和(58.33±4.73)％。而CNE-2与CNE-2GnT-Ⅴ/NCmRNA及蛋白的表达相比均无统计学差异（P分别为0.987和0.649）。
　　 3、下调GnT-Ⅴ的表达对体外传代鼻咽癌细胞放射敏感性的影响
　　 (1)通过平板克隆实验检测CNE-2，CNE-2GnT-Ⅴ/NC，CNE-2GnT-Ⅴ/1564和CNE-2GnT-Ⅴ/2224四组细胞的暴露于不同剂量的射线下的克隆存活能力。放射后(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)，CNE-2GnT-Ⅴ/NC生存分数在各剂量组均大于CNE-2GnT-Ⅴ/2224组（P均＜0.001），6Gy时两细胞间生存分数相差最大[(39.77±5.15)％VS(14.44±2.45)％]。0Gy四组细胞生存分数值无统计学差异(F=0.137，P=0.937)，说明铺板时四组细胞数目无显著差异。且CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2GnT-Ⅴ/1564组在各放射剂量相比，均无显著差别(P分别为0.356、0.432、0.548、0.649)。计算出CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞的放射增敏比为1.39。表明下调GnT-Ⅴ的表达后CNE-2细胞的放射敏感性增强。
　　 (2)通过CCK-8实验检测CNE-2，CNE-2GnT-Ⅴ/NC，CNE-2GnT-Ⅴ/1564和CNE-2GnT-Ⅴ/2224四组细胞暴露于不同剂量射线下的存活能力。以细胞在暴露不同放射剂量(0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)的生存率值绘制细胞存活曲线，并计算出CNE-2GnT-Ⅴ/2224的存活率。可见CNE-2GnT-Ⅴ/NC生存分数在各剂量组(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)均大于CNE-2GnT-Ⅴ/2224组（P均＜0.001），6Gy时两细胞间存活率相差最大[(80.89±1.18)％VS(64.45±1.42)％]。且CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2GnT-W1564组在各放射剂量(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)相比，均无显著差别(P分别为0.998、0.652、0.381、0.184)。表明下调GnT-Ⅴ的表达后CNE-2细胞的放射敏感性增强。
　　 平板克隆及CCK-8实验均提示:下调GnT-Ⅴ的表达增加了CNE-2的放射敏感性。而且干扰GnT-Ⅴ表达的CNE-2GnT-W1564，CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞株之间无明显统计学意义。可能因为两干扰组细胞GnT-Ⅴ表达差别过小，在功能实验中，未检测出其细胞放射敏感性差异。另外，CNE-2GnT-Ⅴ/2224和CNE-2/NC之间的差异在放射剂量为6Gy时，两者的统计学差异最明显，故在后续体外细胞学试验中，选择CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞及选用放射剂量为6Gy进一步研究下调GnT-Ⅴ对CNE-2的放射敏感性的影响。
　　 (3)通过流式细胞实验检测CNE-2，CNE-2GnT-Ⅴ/NC和CNE-2GnT-Ⅴ/2224三组细胞暴露于不同剂量(0Gy、6Gy)射线下细胞的凋亡情况。0Gy时CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2GnT-Ⅴ/NC组相比凋亡率轻微增加[（7.24±0.84）％VS(4.38±0.86)％，P=0.004]。6Gy时CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2GnT-Ⅴ/NC组相比凋亡率明显增加[（34.73±2.36）％VS（13.21±1.00）％，P＜0.001]。说明下调GnT-Ⅴ的表达后CNE-2细胞放射诱导的凋亡加剧。
　　 (4)利用caspase-3活性实验检测CNE-2，CNE-2GnT-Ⅴ/NC和CNE-2GnT-Ⅴ/2224三组细胞的暴露于不同剂量(0Gy、6Gy)射线下细胞的caspase-3活性情况。0Gy时CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2组相比caspase-3活性增加到（132.67±15.98）％(P=0.008)。而6Gy时CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2组相比caspase-3活性明显增加[(863.17±20.25)％VS(426.50±18.94)％，P＜0.001]，而CNE-2和CNE-2GnT-Ⅴ/NC细胞放射组或非放射组相比caspase-3活性均无显著差别。说明下调GnT-Ⅴ的表达后CNE-2细胞放射导致的caspase-3活性明显增加，从而导致细胞走向凋亡增加。
　　 4、下调GnT-Ⅴ的表达对鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤放射敏感性的影响
　　 为了证实体外实验中GnT-Ⅴ在人鼻咽癌细胞中的作用，体内实验用裸鼠皮下成瘤和分次放射模型进一步研究。皮下成瘤组织用H&E染色显微镜下病理证实。
　　 标化体积数据及曲线均显示3组瘤体放射组与非放射组相比，生长均减慢，而与CNE-2GnT-Ⅴ/NC组相比，CNE-2GnT-Ⅴ/2224组的减慢程度更大[第4天抑制率:（32.36±4.89）％VS(17.97±4.58)％、第7天抑制率:（52.30±4.55）％VS（28.51±4.16）％、第10天抑制率（67.16±4.19）％VS（34.55±4.84）％P均＜0.001]。说明与正常CNE-2细胞相比，在干扰GnT-Ⅴ表达后，裸鼠皮下CNE-2成瘤组织中，如接受放射治疗会受到更加剧烈的生长抑制。
　　 5、下调GnT-Ⅴ的表达对鼻咽癌细胞放射诱导的细胞周期的影响
　　 通过流式细胞仪得出0Gy时CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2GnT-Ⅴ/NC组细胞G2-M期比例无显著差异(P＝0.367)。6Gy时CNE-2GnT-Ⅴ/2224组与CNE-2GnT-Ⅴ/NC组相比G2-M期阻滞明显加剧[(90.66±2.02)％VS（65.97±2.42）％，P＜0.001]。说明下调GnT-Ⅴ表达后，人鼻咽癌细胞株CNE-2放射诱导的细胞G2-M期阻滞加剧。
　　 6、下调GnT-Ⅴ的表达对CNE-2细胞Bcl-2、Bax、Bcl-x(l)、Bcl-2/Baxratio的影响
　　 为了探索Bcl-2家族蛋白在肿瘤放射敏感性改变中起的作用，Bcl-2及相关蛋白(Bcl-x(l)和Bax)分别在细胞学水平及裸鼠成瘤模型中对比放射组与非放射组的表达情况。
　　 (1)细胞学实验中Westernblot结果表明:0Gy组CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞与CNE-2GnT-Ⅴ/NC细胞相比:Bcl-2表达下降了(34.59±4.01)％，Bcl-x(l)表达下降了(41.37±3.51)％，Bax增加了(23.11±7.19)％。Bcl-2/Baxratio下降(47.11±3.62)％。6Gy组CNE-2GnT-Ⅴ/2224组表达进一步下降(56.53±6.09)％，Bax进一步增加(45.14±5.88)％。Bcl-2/Baxratio进一步下降(70.12±3.71)％，而CNE-2GnT-Ⅴ/NC中放射组与非放射组相比Bcl-2、Bax、Bcl-2/Baxratio均无显著统计学差异;CNE-2GnT-Ⅴ/NC或者CNE-2GnT-Ⅴ/2224中放射组与非放射组相比，Bcl-x(l)表达均无统计学差异。
　　 (2)裸鼠成瘤实验中Westernblot结果表明:非放射组CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞与CNE-2GnT-Ⅴ/NC细胞相比:Bcl-2表达下降了(45.31±4.62)％，Bcl-x(l)表达下降了(51.65±4.97)％，Bax增加了(29.97±6.85)％。Bcl-2/Baxratio增加了(58.28±3.13)％。放射组CNE-2GnT-Ⅴ/2224表达进一步下降(65.18±4.56)％，Bax进一步增加(59.42±9.78)％。Bcl-2/Baxratio进一步下降(78.03±3.92)％，而CNE-2GnT-Ⅴ/NC中放射组与非放射组相比Bcl-2、Bax、Bcl-2/Baxratio均无显著统计学差异;CNE-2GnT-Ⅴ/NC或者CNE-2GnT-Ⅴ/2224中放射组与非放射组相比，Bcl-x(l)表达均无统计学差异。
　　 相应地，裸鼠成瘤实验中免疫组化结果表明:非放射组CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x(l)表达比CNE-2GnT-Ⅴ/NC细胞弱，而放射组Bcl-2表达变得更弱、Bcl-x(l)未发现继续减弱。非放射组CNE-2GnT-Ⅴ/2224细胞凋亡蛋白Bax表达比CNE-2GnT-Ⅴ/NC细胞强，而在放射组中这种表达差距更加明显。CNE-2GnT-Ⅴ/NC放射组与非放射组相比，Bcl-2、Bcl-x(l)、Bax表达未见明显差别。
　　 五、结论
　　 1、靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表达质粒可以下调GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表达。
　　 2、下调GnT-Ⅴ表达后，CNE-2细胞的放射敏感性增强。其潜在的机制可能与G2-M期阻滞、Bcl-2/Bax比率下降有关，而可能与Bcl-xl表达无关。
　　 3、GnT-Ⅴ可能是一个潜在的预测鼻咽癌放射敏感性的分子标记物。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 结果

3．1 重组质粒的稳定转染

3．2 干扰效果检测

3．3 下调GnT-V的表达对体外传代鼻咽癌细胞放射敏感性的影响

3．4 下调GnT-V的表达对鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤放射敏感性的影响

3．5 下调GnT-V的表达对鼻咽癌细胞放射诱导的细胞周期的影响

3．6 下调GnT-V的表达对CNE-2细胞Bcl-2、Bax、Bcl-xl、Bcl-2／Bax ratio的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

硕士期间发表的论文及取得的成果

致谢

声明

统计学审稿证明