鞘内注射Il-18中和抗体对大鼠吗啡耐受形成的影响

摘要

吗啡是临床广泛应用的强效镇痛药，也是治疗譬如慢性癌痛等多种慢性疼痛的最后选择。但长期应用吗啡后其镇痛作用逐渐减弱，即产生所谓的吗啡耐受效应。吗啡的成瘾性和耐受性迫使患者为获得满意的镇痛效果而加大药量，进而更增加了吗啡的副作用。因此探讨吗啡耐受的机制，有效地防治吗啡耐受是基础和临床研究共同关注的一个热点话题。吗啡耐受的机制十分复杂，近年来研究人员对此做了大量研究。多项研究提示胶质细胞活化，尤其是脊髓小胶质细胞及星形胶质细胞的活化，与吗啡耐受的发生密切相关。与神经病理性疼痛研究结果相似，大量研究提示:抑制小胶质细胞活化仅能预防吗啡耐受的发生，却不能缓解已存在的吗啡耐受。而非特异性胶质细胞抑制剂丙戊茶碱则既能预防吗啡耐受的发生，也能缓解已存在的吗啡耐受。据此推测吗啡耐受可能是由脊髓小胶质细胞的活化引起的，而星形胶质细胞的持续活化则对吗啡耐受起到了维持作用。
　　 2008年Miyoshi等研究发现脊髓中IL-18介导的小胶质细胞与脊髓星形胶质细胞的相互作用能够增强神经损伤后的神经病理性疼痛。IL-18主要在小胶质细胞中表达，而IL-18 R则主要在星形胶质细胞中表达。IL-18介导脊髓中小胶质细胞与星形胶质细胞的相互作用的机制是:神经病理性损伤发生后，TLR4被激活并通过MAPKp38信号通路引发小胶质细胞的激活，通过TLR4/MAPKp38通路激活的小胶质细胞释放IL-18到胞外，并通过旁分泌的方式作用于星形胶质细胞上的IL-18&IL-18与IL-18R的特异性结合增强了星形胶质细胞中NF-κB的磷酸化，导致了GFAP的上调，并且IL-18R的激活对星形胶质细胞中IL-18R的表达起到了正调节作用。生成的IL-18或其他细胞因子又可以通过自分泌或旁分泌的方式刺激小胶质细胞和星形胶质细胞，进而引起更多的促炎性细胞因子(如IL-1β，IL-6，TNF-α)、环氧化酶2(COX-2)以及一氧化氮合酶(NOS)的生成，胶质细胞生成的这些促炎因子还可以作用于脊髓背角神经元，进而引起另一系列反应。
　　 Miyoshi等的实验表明L5脊神经结扎后脊髓小胶质细胞表达IL-18明显增加，TLR4/MAPKp38通路促进了IL-18的释放;而L5脊神经结扎后脊髓星形胶质细胞表达IL-18受体亦明显增加，阻断IL-18或IL-18受体信号，能明显减轻神经损伤诱导的触觉过敏，并抑制星形胶质细胞标志物GFAP的表达，及NF-κB的磷酸化。实验表明神经损伤能够分别诱发脊髓背角中小胶质细胞和星形胶质细胞中IL-18和IL-1gR的增加，而IL-18介导的小胶质细胞与星形胶质细胞的相互作用对于通过神经胶质细胞的特定信号转导级联引起的痛觉过敏的发展与维持起着决定性作用。
　　 IL-18是IL-1家族成员，与IL-1β有很多相似之处，而IL-1β在吗啡耐受中的作用早已明了，Shavit等研究发现慢性吗啡耐受能够引起IL-1β释放增多。由于导致吗啡耐受和神经病理性疼痛的分子机制有着众多的相似性，实验证实脊髓中IL-18介导的小胶质细胞与脊髓星形胶质细胞的相互作用能够增强神经损伤后的神经病理性疼痛，我们推测它可能也参与了吗啡耐受的形成。即小胶质细胞活化并释放的IL-18，作用于星形胶质细胞表面的IL-18受体，导致了星形胶质细胞的活化，吗啡耐受的维持。阻断脊髓内IL-18信号，可能为吗啡耐受的防治提供一条新的途径。基于这个假设，本实验通过鞘内给予特异性的IL-18中和抗体，阻断脊髓IL-18信号传导，探讨其对大鼠皮下注射吗啡诱导的吗啡耐受形成的影响，并分析其可能的作用机制，为防治吗啡耐受提供一条新的思路和科学的理论依据。
　　 目的:观察选择性阻断脊髓IL-18信号对皮下注射吗啡诱导的慢性吗啡耐受的影响，明确IL-18信号在慢性吗啡耐受中的作用，为防治吗啡耐受提供新的思路和科学的理论依据。
　　 方法:雄性SD大鼠50只，用改良的的Yaksh法进行鞘内置管，建立鞘内置管模型。具体操作为大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠60 mg·kg-1麻醉后，大鼠取俯卧位，置于动物手术台上，将大鼠腰部垫高，摸清两侧髂嵴，其连线与棘突的交点即为L6棘突。以L5-6间隙为中心作一长约1cm的皮肤纵向切口，依次切开大鼠皮肤、皮下筋膜，暴露肌层。钝性分离附着于L5-6棘突两侧的肌肉，暴露L5-6椎间隙，以稍钝针头穿破黄韧带及硬脊膜，可见大鼠出现甩尾反射及清亮脑脊液外溢。用镊子夹住已经消毒并裁剪成固定长度的PE10导管一端轻柔地将其向上置入，导管置入深度约为2cm。将导管于皮下筋膜处缝扎固定，并经皮下隧道自颈部将其引出，外露2cm左右。之后用20μl生理盐水冲洗导管，若导管顺畅，将导管顶端用火封闭，防止脑脊液外溢。用生理盐水冲洗伤口后依次缝合伤口。置管五天后，将后肢瘫痪或有明显运动障碍的大鼠排除，用微量注射器将2％利多卡因20μl缓慢注入后肢无明显运动障碍的大鼠鞘内，约10秒左右大鼠两后肢不能负重、拖地或用针刺后肢无回缩等逃避反射，10分钟左右又恢复负重者，则证明导管位置正确，为建模成功大鼠，列入实验组（记作实验第1天），可进行后续实验。否则为失败模型，舍弃。建模不成功大鼠予以2％戊巴比妥钠80 mg·kg-1麻醉处死。
　　 因建模成功率约为80％，故50只大鼠取建模成功大鼠40只，随机分为5组，每组8只(n=8)。Ⅰ组为生理盐水对照组，Ⅱ组为吗啡耐受组，Ⅲ组为IgG对照组，Ⅳ组为0.4μg IL-18中和抗体处理组，Ⅴ组为4μg IL-18中和抗体处理组。
　　 第3-9天，建立慢性吗啡耐受模型以及各组进行相应处理。每日8:00-9:00与16:00-17:00，Ⅱ-Ⅴ组大鼠分别皮下注射吗啡(10 mg·kg-1)一次，Ⅰ组为皮下注射等量生理盐水，连续7天，2次/日。连续注射吗啡7天以后，若与生理盐水对照组相比，行为学测试显示吗啡耐受组大鼠的吗啡镇痛效能明显下降，则提示慢性吗啡耐受模型建立成功。每日上午给予吗啡前30 min，Ⅰ组、Ⅱ组鞘内给予1×PBS缓冲液，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组鞘内分别给予IgG4μg，IL-18中和抗体0.4μg、4μg。鞘内给药均为20山(IgG，IL-18中和抗体均采用PBS缓冲液溶解稀释)。
　　 第2天及第10天，进行行为学测试。应用足底辐射热痛觉测试仪测定各组大鼠热刺激缩足反应潜伏期PWTL。测痛时室温保持在25℃左右，尽量营造恒温、安静环境。将大鼠放进有机玻璃隔间中适应环境15分钟。准备工作完成后，待大鼠安静后将红外光源移至大鼠左后爪下面，按“开始”按钮开始照射大鼠左后爪，可看到数字计时器开始计时。待大鼠感觉疼痛将后肢抬起后，仪器自动检测到并停止计时，仪器显示器显示数字即为此次大鼠热刺激缩足反应潜伏期PWTL，精确到0.01秒。每只大鼠重复测量5次，间隔5分钟，测量部位相同，为避免长时间光照损伤大鼠后爪单次光照时间不超过20秒(cutoff time)，去掉最大及最小值，取平均值即为大鼠的基础潜伏期。之后，由大鼠尾静脉注射吗啡(4 mg·kg-1)，测定给予吗啡后30 min的热刺激缩足反应潜伏期PWTL，取平均值即为大鼠给药后潜伏期。每次测量时为减小人为误差，操作红外光源，记录数据，尾静脉注射操作均采用专人负责制。数据收集结束后，计算分析30 min的最大可能镇痛效应比值％MPE(percentage of maximal possible antinociceptiveeffect)。
　　 第10天行为学测试结束后，大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠80 mg·kg-1深麻醉，取4只大鼠快速开胸后经左心室插管至升主动脉，先用0.9％生理盐水进行快速灌注，待右心耳流出液呈现淡红色，改用4％多聚甲醛溶液快速灌注固定，留取腰膨大固定于上述多聚甲醛溶液中，用于免疫荧光染色法分析星形胶质细胞标记物GFAP表达水平。另取4只大鼠无需灌注，快速截取脊髓腰膨大，用生理盐水冲去脊髓表面的血丝后于液氮中保存，留待Western-Blot法检测ERK与p-ERK蛋白表达水平。
　　 结果:1、行为学测试结果显示，第2天:各组大鼠给予吗啡后30 min％MPE差异无统计学意义(P＞0.05)。第10天:给予吗啡30 min后，与Ⅰ组生理盐水对照组（99.70±0.85）％相比，其余四组％MPE均明显降低(P＜0.05)。而与Ⅱ组吗啡耐受组（16.33±7.99）％相比，Ⅲ组IgG对照组（17.28±5.27）％、Ⅳ组0.4μg IL-18中和抗体处理组（26.85±6.46）％差异无统计学意义(P＞0.05)。但与Ⅱ组吗啡耐受组（16.33±7.99）％相比，Ⅴ组4μgIL-18中和抗体处理组(49.38±17.53)％明显升高(P＜0.05)。2、免疫组织荧光染色结果显示，在Ⅰ组生理盐水对照组中，大鼠腰段脊髓背角星形胶质细胞标志物GFAP表达量较少。与Ⅰ组生理盐水对照组相比，Ⅱ组吗啡耐受组GFAP表达量明显增加，表现为GFAP免疫阳性细胞的胞体粗大，突起亦变粗、增多，呈强阳性，即吗啡耐受组大鼠腰段脊髓背角星形胶质细胞标志物GFAP的免疫活性明显增强，吗啡诱导了脊髓星形胶质细胞的活化。Ⅲ组IgG对照组以及Ⅳ组0.4μg IL-18中和抗体处理组与Ⅱ组吗啡耐受组相比，星形胶质细胞表达量和形态均无明显差异。而Ⅴ组4μgIL-18中和抗体处理组在连续注射吗啡的同时采用大剂量IL-18中和抗体阻断脊髓IL-18信号通路，结果显示GFAP的表达量明显降低，呈弱阳性，细胞胞体及突起略微增多增粗，免疫反应程度介于生理盐水对照组与吗啡耐受组之间。3、western blot结果显示，五组大鼠腰段脊髓Erk表达量均无明显统计学差异(P＞0.05)，即各组大鼠腰段脊髓总Erk表达量差异不大。而与Ⅰ组生理盐水对照组（100.00±.00）相比，其余各组p-Erk表达量均升高(P＜0.05)，即吗啡耐受大鼠Erk通路被激活，p-Erk表达量明显增多。与Ⅱ组吗啡耐受组（150.23±4.40）相比，Ⅲ组IgG对照组（149.07±2.56）、Ⅳ组0.4μg IL-18中和抗体处理组（146.30±3.68）p-Erk表达水平均无明显统计学意义(P＞0.05)。但与Ⅱ组吗啡耐受组(150.23±4.40)相比，Ⅴ组4μg IL-18中和抗体处理组p-Erk表达水平（111.75±2.25）明显降低(P＜0.05)，即连续注射吗啡的同时采用大剂量IL-18中和抗体阻断脊髓IL-18信号通路，显著降低了p-ERK的表达量。
　　 结论:皮下注射吗啡的同时采用大剂量IL-18中和抗体阻断脊髓IL-18信号通路，在一定程度上缓解了吗啡耐受的形成，该效应可能与其抑制吗啡诱导的脊髓背角星形胶质细胞的活化及Erk通路的激活有关。

目录

摘要

前言

第一章 实验动物和材料

1．1 实验动物

1．2 药品和试剂

1．3 仪器设备

第二章 实验方法

2．1 建立鞘内置管模型

2．1．1 鞘内置管

2．1．2 确定导管位置

2．2 实验分组

2．3 建立吗啡耐受模型

2．4 给药方案

2．5 行为学测试

2．5．1 热刺激缩足反应潜伏期的测量

2．5．2 最大可能镇痛效应比值％MPE的计算

2．6 标本采集

2．6．1 免疫荧光染色标本

2．6．2 免疫印迹标本

2．7 免疫组织荧光染色

2．8 Western-Blot法检测ERK与p-EPK蛋白表达

2．9 统计学分析

2．10 技术路线图

第三章 实验结果

3．1 热痛测试结果

3．2 脊髓背角星形胶质细胞标记物GFAP荧光表达变化

3．3 脊髓腰膨大ERK与p-ERK蛋白表达变化

第四章 讨论

4．1 大鼠鞘内置管模型

4．2 大鼠吗啡耐受模型的建立

4．3 IL-18与吗啡耐受

4．4 IL-18中和抗体与吗啡镇痛作用

4．5 IL-18中和抗体与大鼠脊髓GFAP表达

4．6 IL-18中和抗体与大鼠脊髓ERK、p-ERK表达

第五章 结论

参考文献

附录·中英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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