紫苏异酮对肝癌细胞的放疗增敏及其作用机制探讨

摘要

背景和目的：
　　 美国肿瘤协会2012年最新统计结果表明，肝癌在男性恶性肿瘤致死率中排名第五位，女性恶性肿瘤致死率排名第九位，是世界卫生组织公布的十大肿瘤之一，每年因肝癌死亡人数约70万。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤，其病情隐蔽且发展速度快，很多患者发现时已为中晚期，因而成为严重威胁人类健康和生命的元凶。放射治疗(Radiation Therapy, RT)是肝癌综合治疗中的重要组成部分，尤其是对于较晚期的肝癌，放射治疗的作用更是显得尤为重要，然而高剂量的放射治疗会给患者带来严重并发症和副反应，某些类型的肝癌细胞对于放疗敏感性较低，甚至产生放射抵抗。因此寻找一种理想的放疗增敏剂，既可以有效抑制肿瘤细胞生长，又能够增加肿瘤细胞对于放疗的敏感性，成为目前抗肿瘤研究中的一个重要方向。
　　 肝癌是一种特殊的肿瘤，其中很多患者来源于乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)感染，而HBx阳性的患者常常表现出对于放疗或化疗的不敏感，有些放疗增敏剂如紫杉酚对于HBx阳性的肝癌细胞作用就不很明显，因此寻找一种对HBx阳性患者也有效的药物是非常重要的。在我国，HBV慢性感染是肝癌的主要危险因素，目前我国有将近1亿的HBV慢性感染者，其中约3000万患者被诊断为活动性慢性乙肝，其中15-40％最终会发展为肝硬化或肝癌。因此肝癌患者中有一部分是HBV阳性的，在手术或放化疗等治疗方案中应注意辅以抗病毒、中药保肝等辅助治疗，区别不同的肝癌患者进行个体化治疗有利于取得良好的治疗效果，改善患者的预后。HBV属于嗜肝病毒科，基因组为长约3.2Kb的不完整双链DNA，长链为负链，短链为正链，其基因组包括4个相互重叠的开放读码框，分别名为S、C、P、X区，X区编码的HBx蛋白的二级结构包含4个α螺旋，4个β片层，第105～148位氨基酸富含负电荷，形成一亮氨酸锌指结构，这是反式激活因子非常典型的激活功能域，该结构是HBx蛋白反式激活功能的结构基础。
　　 HBx可以对包括HBV在内的多种病毒和细胞的基因转录进行调控，如c-myc、c-fos、c-jun等基因，以及劳氏肉瘤病毒(RSV)长末端重复序列(LTR)、SV40早期启动子以及p53基因启动子，导致细胞周期以及增殖紊乱，干扰肝细胞的某些正常基因表达，这可能是HBV病毒致癌的主要原因。诸多研究还表明，HBx通过活化补体分子、诱导抗凋亡信号激活、阻断DNA损伤反应等不同方式保护肝癌细胞逃逸凋亡和DNA损伤，产生对不良刺激的抗性以及多药耐药性。在遭遇外界刺激如紫杉酚处理时，HBx通过阻断核糖体蛋白L11和MDM2的相互作用下调p53和p21，使肝癌细胞逃逸正常凋亡，维持生长增殖，增强了肝癌细胞对于药物的抗性。此外HBx还可上调补体调节蛋白CD46和CD59，从而抵抗补体依赖性的细胞毒性对肝癌细胞HepG2的杀伤。HBx是参予多条信号转导通路的关键分子，是肝癌综合治疗中一个潜在的靶位点，本研究针对HBx表达情况不同的细胞分析IK处理的差异，以期开发新的放疗辅助药物。检测HBV阳性肝癌细胞中HBx蛋白对于放疗敏感性的影响，对于制定针对性强且高效有益的治疗方案降低可能存在的放疗抗性是非常必要的。
　　 近年来大量研究表明，信号调控的紊乱是肿瘤发生、发展的重要内在原因，肝癌的发生涉及到多条分子通路的作用。放射性治疗作为肿瘤治疗重要手段之一，对于肿瘤治疗有较为显著的效果，能够直接作用于肿瘤靶组织，也可以直接照射局部转移部位，因为大量的电离辐射(ionizing radiation，IR)所带的能量可以破坏细胞的染色体，使细胞生长停止。所以适用于对抗快速增殖分裂的癌细胞，常常作为癌症直接或辅助治疗的方式。然而在肿瘤治疗的过程中，也存在许多严重的并发症和副反应，诸如局部骨髓抑制、全身免疫力下降、放射性皮炎以及严重胃肠道反应等，严重者甚至威胁患者生命。尤其是部分肿瘤细胞对放射性治疗的敏感性低，或产生抗性，且肝癌的放疗较为特殊，肝脏及其周围的器官对放疗的耐受性低，使得有时给予靶区的剂量难以达到根治的剂量，这就需要通过放疗增敏的办法，在保护肝脏以及周围器官的前提下，提高肝癌放射性治疗的生物学效应，从而提高放射性治疗的效果。目前临床上应用较多的放疗增敏药有泰素帝和顺铂等，但是这些药物都对肝脏有一定毒副作用，缺乏保肝护肝的功能，严重降低病人的生活质量。所以选择高质量的放疗增敏剂是非常必要的，可以增强肿瘤细胞对放射性治疗的敏感性，降低肿瘤治疗过程的放射剂量，提高患者生存质量，这个问题就成为了肿瘤治疗中的焦点之一。
　　 近年来对于放敏剂的研究日益变热，传统中药的地位逐渐上升，紫苏以其温和的药性和良好的抗肿瘤作用受到研究者的青睐。大量的实验研究表明，紫苏提取物具有抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡的功能，其主要成分如迷迭香酸、咖啡酸、紫苏酮等均对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用。紫苏异酮(IK)具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用，可促进Bid裂解增强，Bax发生转位，细胞色素酶c释放，AIF(apoptosis inducing factor,凋亡诱导因子)转位入核，使凋亡相关酶如Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活性明显上升。IK可以同时启动Caspase依赖性以及Caspase非依赖型凋亡通路实现对于肿瘤细胞的凋亡诱导。此外IK还可以抑制STAT1的磷酸化以及NF-κB的活化，NF-κB是具有多向性调节功能的核转录因子，其活化能够激活抗凋亡基因的表达（如TRAF1、c-IAP1、A1/Bfl-1，Bcl-xL等），阻止凋亡通路下游分子Caspase-8活化，从而切断caspase级联反应链的活化，使细胞逃避凋亡。而IK对于STAT1和NF-KB的抑制可以阻断细胞的凋亡逃逸，使细胞增殖受到抑制。Lin等发现紫苏全叶提取物可以抑制HepG2细胞的增殖，上调Fos-B、Jun-B、Caspase-8的表达，诱导Fos/Jun信号介导的细胞凋亡，并活化TNF-α从而对肝癌细胞起到生长抑制的作用。Kwak等用紫苏叶提取物作用于HL-60细胞，发现该提取物以一种剂量依赖性的方式抑制肿瘤细胞增殖，且紫苏提取物作用之后HL-60细胞出现了G0/G1期细胞阻滞，并检测到上升的Caspase-8、Caspase-9活性，GRP78、磷酸化TIF2α、p21等表达上调，分析紫苏提取物是通过诱导线粒体途径、死亡受体途径、内质网途径的凋亡以及p21介导的G1细胞周期阻滞达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。Osakabe等以致癌剂佛波酯和二甲基苯并蒽建立小鼠两阶段皮肤肿瘤发生模型发现，紫苏提取物处理组的胞间黏附分子1、血管细胞粘附分子1、TRA诱导的趋化因子KC和巨噬细胞炎症蛋白2表达均显著下降，前列腺素E2、白三烯B4和COX2蛋白也显著下调，活性氧自由基检测实验表明发现，紫苏提取物处理组自由基产生量明显下降，且氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷产生不明显。紫苏提取物可以抑制炎症反应信号通路和清除活性氧自由基。Ueda等也做过类似实验，用佛波酯TPA和二甲基苯并蒽DMBA诱导小鼠皮肤乳头状瘤，处理组给予紫苏提取物饮用水随时给药，对照组用安慰剂，结果处理组肿瘤体积明显小于对照组的肿瘤体积。说明紫苏提取物的确显著抑制肿瘤细胞生长降低肿瘤负荷。此外，紫苏提取物如咖啡酸、迷迭香酸等还被证实具有保肝护肝的作用，安排受试SD大鼠以管饲法摄入紫苏提取物（1000 mg/kg体重），5天后给予药物叔丁基过氧化氢(0.5mmol/kg体重)，发现与对照组相比，肝毒性相关指标比如天冬氨酸转移酶等活性明显降低，内源性抗氧化酶和谷胱甘肽活性明显增高。
　　 因此我们在本课题中选择了紫苏提取物之一的紫苏异酮来进行研究，就是基于紫苏提取物优良的抗肿瘤作用以及天然的保肝护肝特性，可以克服以往增敏剂具有肝毒性的缺点，极有希望其成为一个高质量的肝癌放疗增敏剂。且紫苏提取物的相关研究亦从不同侧面提示我们紫苏异酮作为一个从天然抗癌植物和美味绿色蔬菜-紫苏中提取得到的新药物，将在临床治疗的舞台上展现其巨大潜力。
　　 综上所述，本课题旨在研究和验证紫苏异酮对人肝癌Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的增殖抑制和潜在的放疗增敏作用，探索新的放疗增敏剂以利于开发肝毒性较低的放疗联合方案。观察紫苏异酮联合IR照射对HBx蛋白表达阴性的Huh7细胞HBx蛋白表达阳性的Huh7-HBx细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用的差异，并探讨紫苏异酮在人肝癌细胞放疗过程中的可能调控机制，以期为肝癌的治疗个性化方案提供良好的理论依据。
　　 方法：
　　 一、检测紫苏异酮对于人肝癌细胞的生长增殖的影响
　　 1.首先通过应用不同浓度的紫苏异酮(0μmol/mL,10μmol/mL,20μmol/mL,30μmol/mL,40μmol/mL,50μmol/mL)作用于人肝癌细胞(HepG2细胞、Huh7细胞和Huh7-HBx细胞)和人正常肝细胞L02，分别作用24h、48h、72h，收集细胞，进行CCK-8增殖实验检测紫苏异酮对人肝癌细胞的增殖抑制效果;
　　 2.以不同浓度的紫苏异酮(0μmol/mL,15μmol/mL，30μmol/mL,45μmol/mL)作用于铺板于培养皿上的人肝癌Huh-7细胞和Huh7-HBx细胞，14d后观察集落生长情况，检测IK对于肝癌细胞集落形成的影响，以进一步验证紫苏异酮作用的远期效果;
　　 3.以紫苏异酮处理人肝癌Huh-7细胞和Huh7-HBx细胞后，和对照细胞一起收集、固定、染色后上流式细胞仪分析，留出单标记对照以划定细胞范围，检测细胞周期以及凋亡率。
　　 二、检测紫苏异酮对人肝癌细胞的放疗增敏作用1.通过联合应用不同浓度的紫苏异酮(0μmol/mL,15μmol/mL,30μmol/mL,45μmol/mL)与IR照射(0Gy，2Gy，4Gy,6Gy)作用于Huh7细胞和Huh7-HBx细胞，分别作用24h、48h、72h，观察紫苏异酮对人肝癌细胞的增殖抑制和放疗增敏作用，计算紫苏异酮和IR照射的半数致死剂量LC50和半数致死浓度LD50;
　　 2.以紫苏异酮（联用紫苏异酮的LC50，34μmol/mL）处理铺板于培养皿上的人肝癌Huh-7细胞和Huh7-HBx细胞，辅以不同剂量的IR照射（0Gy，2Gy，4Gy，6Gy)，14d后观察集落生长情况，检测紫苏异酮联合IR照射对于人肝癌Huh7-HBx细胞和Huh7细胞集落形成的影响，以进一步验证紫苏异酮联合IR照射作用的远期效果;
　　 3.以紫苏异酮（联用紫苏异酮的LC50，34μmol/mL）处理铺板于96孔板上的人肝癌Huh-7细胞和Huh7-HBx细胞，辅以IR照射(联用时的LD50，4Gy)，在细胞到达培养时间后裂解处理并加入反应底物，检测Caspase3活性以评定凋亡的发生;
　　 4.以紫苏异酮和IR照射处理人肝癌Huh-7细胞和Huh7-HBx细胞后，和对照细胞一起收集、固定、染色后上流式细胞仪分析，留出单标记对照以划定细胞范围，检测紫苏异酮及IR照射作用后细胞周期调控情况和细胞凋亡率。
　　 三、检测紫苏异酮增强人肝癌细胞放疗敏感性的潜在机制
　　 1.以紫苏异酮联合IR照射处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞，再通过RT-PCR检测促增殖相关蛋白、抗增殖蛋白、促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白在mRNA水平的表达;
　　 2.以紫苏异酮联合IR照射处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞，再通过WesternBlotting蛋白印迹实验检测CyclinD1、CyclinE1、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3蛋白的表达情况。
　　 四、统计学分析所有计量资料结果均用均数±标准差（x±s）表示。将收集数据进行单因素方差分析，在差异显著的前提下进行多重比较，方差齐时采用Bonferroni法，方差不齐运用Dunnett's T3法。两组组间比较应用两独立样本t检验;方差不齐时进行校正，应用t'检验。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS16.0 forwindows统计软件包进行数据分析。
　　 结果：
　　 一、检测紫苏异酮对于人肝癌细胞的生长增殖的影响
　　 1.以人正常肝细胞L02为对照，紫苏异酮对HepG2细胞、Huh7细胞、Huh7-HBx细胞的生长增殖具有明显的抑制作用，且呈显著的剂量时间依赖性。IK作用于HepG2细胞，浓度为50μmol/mL作用48小时，细胞增殖活力仅为34.12±3.91％; IK作用于Huh7-HBx细胞，浓度为50μmol/mL作用48小时，细胞增殖活力为41.95±4.05％; IK作用于Huh7细胞，浓度为50μmol/mL作用48小时，细胞增殖活力为35.01±3.35％。同等剂量的IK在不同时间点对HepG2细胞、Huh7细胞的增殖抑制效果强于Huh7-HBx细胞，具有显著性差异。
　　 2.IK对于Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的集落形成具有明显的抑制作用，且呈IK浓度依赖性，当IK浓度为30μmol/mL, Huh7细胞集落形成率约为14.27％，Huh7-HBx细胞集落形成率约为17.33％。
　　 3.IK处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞使细胞阻滞于G0/G1期，且IK处理可以诱导Huh7细胞和Huh7-HBx发生凋亡，凋亡细胞比例分别为19.51％和16.96％。
　　 二、检测紫苏异酮对人肝癌细胞的放疗增敏作用
　　 1.IK处理和IR照射均能抑制人肝癌Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的生长增殖，细胞增殖活力值均有显著下降;IK联合IR照射对Huh7-HBx细胞和Huh7细胞的增殖抑制有明显的协同增效作用，且呈时间/剂量依赖性。肝癌细胞被作用48h的平均LC50约为IK34μmol/mL+IR4 Gy，HBx阴性的Huh7细胞对于IK和IR联用的敏感性高于HBx阳性的Huh7-HBx细胞。
　　 2.IK联合的IR照射后的Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的集落形成率分别为8.93％和12.4％，与未加处理细胞的集落形成率20.93％和23.53％相比具有显著差异(P＜0.05）。IK分别联合IR照射处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的存活分数SF均显著下降，与单独IR照射处理组有明显差异。IK处理显著增强了Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的放疗敏感性。
　　 3.IK以及IR照射处理后Huh7细胞和Huh7-HBx细胞的凋亡活性强于单独IR照射组，有显著性差异（P＜0.05）。Huh7细胞各组的Caspase-3活性均高于对应的Huh7-HBx细胞组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 4.IK联合IR照射后Huh7细胞和Huh7-HBx细胞凋亡率与IK和IR单独处理的凋亡率相比明显升高，差异显著(P＜0.05），IK对于放射性治疗有协同增敏效应。且IK联合IR照射处理后，Huh7细胞的凋亡率明显大于Huh7-HBx细胞的凋亡率，组间对比具有统计学意义（P＜0.05）。
　　 三、检测紫苏异酮增强人肝癌细胞放疗敏感性的潜在机制
　　 1.IK联合IR照射处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞后抑制增殖蛋白p15、p18、p21、p27、p53的mRNA表达均上调，IK单独处理两种细胞p18、p21、p53的mRNA表达均上调;IK联合IR照射处理细胞后促增殖蛋白Cyclins、Cdk2的mRNA水平下降，IK单独处理Cyclins、Cdk2的mRNA水平下降;IK联合IR照射处理细胞后促凋亡蛋白Fas、TRAILR1、Bax上调，抗凋亡蛋白Bcl-2、FLIP表达下调;IK联合IR照射对于增殖相关蛋白的诱导作用强于IK或者IR单独作用;
　　 2.IK单独处理后，Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达明显下降，单独IR处理Cyclin D1表达变化不明显，Cyclin E1表达下降，IK联合IR照射处理Huh7细胞和Huh7-HBx细胞后Cyclins表达量更低，Bax表达上调，Bcl-2表达下降，Cleaved Caspase-3表达上调。且IK联合处理对于Huh7细胞的诱导效果更为明显。
　　 结论：
　　 1.紫苏异酮是一种非常有效的肝癌放疗增敏剂，对HBsAg阳性和阴性的肝癌细胞增殖均有明显的抑制效果;
　　 2.紫苏异酮可以导致人肝癌细胞发生G0/G1期阻滞和细胞凋亡;
　　 3.紫苏异酮联合IR照射处理对人肝癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导明显优于IR单独作用的效果;
　　 4.紫苏异酮联合IR照射可以诱导促凋亡蛋白的表达，抑制增殖蛋白的表达，且优于IR单独作用的效果;
　　 5.紫苏异酮对于肝癌细胞放疗有显著的协同增敏效应。
　　 创新点：
　　 尝试了一种新的中药提取物进行肝癌细胞的放疗增敏实验，结合紫苏的保肝作用可取得更好的疗效，紫苏异酮的放疗增敏研究尚无相关报道;
　　 设计具有HBx表达差异的细胞来检测紫苏异酮的增敏效果，证实其对于HBx表达与否的细胞均有较好抑制效果;
　　 探讨了紫苏异酮联合IR照射抑制肝癌细胞增殖的可能机制，抑制Cyclins表达，诱导细胞凋亡蛋白Bax，对临床治疗有一定指导意义。
　　 通过实验证实了一种紫苏异酮对于IR照射具有协同增敏效果，对于HBx阳性的细胞也有较好的抑制作用，这些研究有利于制定个体化放疗方案，同时为临床治疗策略的建立也提供了良好理论依据。

目录

摘要

前言

第一章 紫苏异酮对肝癌细胞生长的影响

1．1 材料和主要试剂

1．2 方法

1．3 结果

1．4 结论

第二章 紫苏异酮体外对肝癌细胞放疗增敏的实验研究

2．1 材料和主要试剂

2．2 方法

2．3 结果

2．4 结论

第三章 紫苏异酮对肝癌细胞放疗增敏的凋亡调控研究

3．1 材料和主要试剂

3．2 方法

3．3 结果

3．4 结论

全文总结

附录

参考文献

缩写词简表

致谢

博士研究生期间发表论文情况

声明

统计学审稿证明