血红蛋白诱导一氧化氮合酶过表达与一氧化氮生成在大鼠脑出血后血脑屏障破坏中的作用与意义

摘要

研究背景:
　　 脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一类发病率、致死率、致残率都很高的脑血管疾病，我国每年的发病率约为(60-80)/10万，约占我国全部卒中的20％-30％，其30天内的死亡率可高达44％至50％。脑出血后脑水肿的发生、发展是导致脑出血患者神经功能严重缺损、脑疝甚至死亡的主要原因之一。脑出血后，血管源性脑水肿是脑水肿的主要类型。
　　 作为维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构，血脑屏障(blood-brainbarrier，BBB)的结构和功能障碍是导致脑出血后血管源性脑水肿发生、发展的主要原因之一。血脑屏障由脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接、内皮基膜、周细胞与胶质细胞终足组成。其中，内皮细胞及其间紧密连接是维持血脑屏障功能的关键结构。脑出血后，炎性因子、血红蛋白分解产物、凝血酶、氧化应激、补体和基质金属蛋白酶等因素均可导致BBB的破坏。
　　 红细胞是血液中含量最多的血细胞，也是脑出血后脑内血肿的主要成分，其主要成分是出血红素和珠蛋白组成的血红蛋白(Hemoglobin，Hb)。脑出血后，随着血肿中红细胞裂解，大量Hb释放进入血肿周围脑组织。目前研究发现，脑出血后脑水肿的发生、发展与红细胞的崩解及血红蛋白的释放密切相关。同时，近年研究发现脑出血后早期即有红细胞崩解和血红蛋白在周围组织中的释放和蓄积，且释放的血红蛋白可能是导致血脑屏障损伤的重要病理介质之一。
　　 一氧化氮(Nitric oxide，NO)是体内一种重要的调节分子，是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)以精氨酸为底物合成的。NOS有三种形式，分别为诱导性一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)和神经元型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)。生理状态下，NO在脉管系统和中枢神经系统中发挥着许多重要作用，包括神经传递的调节、局部血流调节和参与免疫反应。然而，由NOS合成释放的过量的NO会产生严重的神经毒性作用。在急性高血压、感染、细菌性脑膜炎和脑缺血中，过量生成的NO会导致BBB结构和功能的破坏。此外，除了NO自身的毒性作用，它的衍生物特别是过氧硝酸盐可产生更严重的损伤作用，包括细胞损伤，兴奋性毒性和BBB破坏。
　　 目的:
　　 本研究通过向大鼠右侧尾状核内注入Hb，检测不同时间点周围脑组织血脑屏障通透性、紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1、JAM-1 mRNA的表达变化、铁离子蓄积情况、NOS和NO表达生成变化，探究Hb对血脑屏障结构和功能的影响，并进一步分析NOS和NO在此过程中的作用。
　　 实验方法:
　　 1、实验分组及模型制作
　　 SPF级SD成年雄性大鼠230只，体质量为250-300g，随机分为正常组、Hb组和假手术组，后两组按照模型完成后观察时间分为6h、12h、24h、48h、3d和7d共6个亚组。立体定向穿刺大鼠右侧尾状核，注射20μl血红蛋白溶液(150g/L)，制作Hb大鼠脑内注入模型。假手术组大鼠在相同位置仅作单纯穿刺。
　　 2、脑组织石蜡切片制作及HE染色
　　 大鼠麻醉后，依次使用生理盐水和4％多聚甲醛溶液经心脏进行灌注。切取损伤处脑组织，浸泡于4％多聚甲醛溶液中继续固定24小时。固定好的脑组织按照常规石蜡包埋方法制作石蜡标本并切片，切片厚度为5 um。组织切片常规脱蜡水化后，使用苏木素染色2.5 min，伊红溶液染色2.5 min，显微镜下观察拍片。
　　 3、血脑屏障通透性检测
　　 大鼠于处死前2小时经股静脉注射2％伊文氏蓝溶液(4 ml/kg)，生理盐水心脏灌注后断头取脑。取Hb周围脑组织，秤量其湿重后，加入2 ml的50％三氯乙酸。37℃孵育72h，充分研磨后15000 rpm离心20 min，取1 ml上清与3 ml无水乙醇混合，应用多功能酶标仪在Ex620nm、Em680nm的条件下测定荧光强度，从标准曲线上查得伊文氏蓝含量，结果以μg/g脑组织表示。
　　 4、实时荧光定量PCR
　　 大鼠麻醉后直接断头，取Hb周围约30 mg脑组织标本，依次使用RNA提取试剂盒、反转录试剂盒骤提取总RNA，并反转录合成eDNA。荧光定量PCR反应条件为95℃10min，(95℃15s，60℃1min)×40个循环。通过标准曲线的相对定量方法检测紧密连接蛋白、NOS mRNA的表达情况。
　　 5、免疫荧光
　　 石蜡切片常规脱蜡至水，置于Tris-EDTA缓冲液(PH8.5)中微波加热进行抗原修复，血清室温封闭后分别滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗后滴加相应荧光二抗，37℃环境下孵育1h。荧光显微镜下观察并拍照。
　　 6、免疫组化
　　 免疫组化检测脑组织中iNOS和eNOS表达、分布变化。石蜡切片脱蜡、水化后，使用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液微波加热30 min进行抗原修复。修复完毕后依次滴加0.3％过氧化氢溶液、山羊血清、一抗、生物素化二抗和辣根酶标记链霉卵白素工作液进行孵育。DAB显色，封片后在显微镜下观察、分析。
　　 7、脑组织NO含量测定
　　 大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉后，打开胸腔，暴露心脏和主动脉，并经左心室插管至主动脉，使用预冷的生理盐水灌注。待流出液变清亮后断头取脑，取Hb周围脑组织。按照硝酸还原酶法测定脑组织中NO含量，以每克脑组织的NO含量表示。
　　 8、铁染色及半定量分析
　　 石蜡切片常规脱蜡水化后，使用普鲁士蓝溶液（5％亚铁氰化钾溶液和5％盐酸按1∶1混合）染色30 min;蒸馏水冲洗5次后滴加1％DAB溶液孵育15 min;0.03％H202和0.5％DAB染色10 min后苏木素-伊红复染。每个样本随机选择5张图片测定平均光密度值，并进行半定量分析。
　　 9、统计学方法
　　 应用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准误((x)±SE)表示，两组间比较采用t检验，多组问比较采用ONE-WAY方差分析，多重比较用LSD-t检验。NO生成和BBB通透性之间的相关性采用Pearson检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 实验结果:
　　 1、HE染色观察Hb注入大鼠脑内后不同时间点脑组织病理变化。Hb注入大鼠脑内后，在Hb周围可见明显的水肿坏死带，表现为组织疏松，细胞变性、坏死，核固缩、碎裂，细胞水肿。Hb周围正常的神经细胞数目减少，并有大量炎性细胞浸润。至7天时水肿坏死带逐渐消失，可见少量残留的Hb，主要集中于血管周围。
　　 2、通过检测伊文氏蓝的渗出评价BBB的通透性改变。在假手术组，伊文氏蓝的渗出量较少，并保持相对恒定水平。假手术各个时间点之间以及与正常对照组之间均无统计学差异。然而，在Hb注入大鼠脑内后6h至7d，脑组织伊文氏蓝的渗出量有显著的增加，提示BBB通透性明显升高。Hb注入后的各个时间点与对应的假手术组及正常对照组之间均有显著的统计学差异(P＜0.05)，其中Hb注入后12h增高最为明显(P＜0.05)。
　　 3、Hb注入后，紧密连接蛋白在mRNA水平表现出不同的变化趋势。在Hb注入后6h，claudin-5 mRNA的表达即有明显减低，12h时表达量达到最低，并维持低表达水平至第7天。除了24h，Hb组与假手术组均有明显差异(P＜0.05)。Hb组各时间点与正常水平均有统计学差异（P＜0.05）。Hb注入后6h和12h，occludinmRNA表达显著减少。24h时其表达基本恢复正常水平，至3天时与假手术组无统计学差异。7d时其表达是正常水平的5倍(P＜0.001)。Hb注入后6h，ZO-1 mRNA表达有轻微减少。12h时开始明显降低，并随时间继续减少。在7天时，ZO-1 mRNA表达量降至最低。除了24h和3d，在Hb注入后的其它时间点有JAM-1 mRNA表量的显著降低(P＜0.05)。
　　 4、免疫荧光观察紧密连接蛋白的表达、分布变化。在假手术组的血管内皮细胞间，紧密连接蛋白表达完整，并呈连续条带状分布。在Hb组，claudin-5和ZO-1的表达弥散、不连续，在中小血管上最为严重。在在Hb注入的早期，中小血管上的occludin表达减少。
　　 5、通过增强铁染色及半定量分析了解铁离子蓄积情况。在正常组和假手术组均没有发现铁染色的阳性表达。Hb注入后48h时，在损伤处发现有铁离子的阳性染色。半定量分析提示在48h时，相对于正常组和假手术组有明显增加（P＜0.05）。在3d和7d时仍持续较高水平。铁离子的蓄积主要出现在胶质细胞。有些情况下，特别是在第7天，铁的蓄积可出现在血管内皮细胞。
　　 6、Hb注入后，iNOS mRNA表达明显增加。在6h时，其表达约为正常组或假手术组表达量的100倍(P＜0.001)。直至48h，iNOS mRNA仍保持高水平的表达。随后在3d和7d时，iNOS mRNA表达量较正常水平明显减少（P＜0.05）。与iNOS不同，eNOS mRNA在Hb注入后6h和12h有轻度的增高。在24h，其表达量明显高于正常组和假手术组，约为正常水平的4倍（P＜0.05）。然后，其表达量在48h(P＜0.05)和7d(P＜0.001)较正常水平明显降低。
　　 7、通过免疫组化进一步观察iNOS和eNOS的表达、分布变化。iNOS阳性反应广泛分布于Hb血肿周围，主要位于胶质细胞和炎性细胞。有些情况，在内皮细胞也发现有iNOS的阳性表达。24h时，在损伤侧周围eNOS阳性最为明显，在假手术组未见明显阳性表达。
　　 8、通过硝酸还原酶法检测脑组织中NO的生成来量。在Hb组12h，NO生成开始增加，3天时达到高峰，随后至7天时降低至基础水平。与正常水平相比，12h(P＜0.05)、24h(P＜0.001)、48h(P＜0.001)和3d(P＜0.001)时的NO含量有显著增加。NO的生成与血脑屏障的通透性升高之间有显著正相关性(i=0.532，P＜0.05)。
　　 9、通过claudin-5和iNOS或eNOS的荧光双染，进一步探究NOS在血脑屏障破坏中的作用。在假手术组，血管周围没有明显的iNOS和eNOS表达，此时claudin-5表达完整、强烈。在Hb组，在血管周围发现iNOS的增强表达。在损伤侧血管内皮细胞中也有eNOS的表达。伴随iNOS或eNOS表达的血管的claudin-5表达弥散、不连续，这表明NOS和BBB破坏之间有紧密联系。
　　 结论:
　　 1.Hb可引起脑内血管内皮细胞紧密连接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1和JAM-1表达、分布变化，进而导致血脑屏障功能障碍。
　　 2.Hb可引起脑实质内iNOS、eNOS表达显著增加，进而合成和释放过量的NO。过量表达的iNOS、eNOS位于claudin-5破坏的部位。
　　 3.Hb引起的BBB结构和功能破坏可能与iNOS、eNOS过量表达、NO释放增加有关，参与脑出血后脑水肿的发生、发展过程。

目录

摘要

前言

第一章 血红蛋白对大鼠脑出血后血脑屏障的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章 一氧化氮合酶与一氧化氮在血脑屏障破坏中的作用与意义

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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