自体血管内皮祖细胞抗衰老作用的初步临床研究

摘要

[背景]
　　 老龄化问题被认为是21世纪三大世界性社会问题之一。WHO对老龄化的定义是如果一个国家的60岁以上老年人口占人口总数的10％，或65岁以上老年人口占总人口数的7％，即这个国家已经步入老龄化阶段。发达国家是最早步入老龄化阶段的国家，自20世纪70年代以来，世界各国人口年龄结构的老龄化过程存在着差异。截至2006年底，我国已经是老龄化人口唯一超过1亿的国家，到2050年我国衰老人口将占总人口的四分之一。
　　 目前研究认为衰老和老年病的发生是相关联的，二者具有相同的病理生理过程，如免疫系统损伤、神经内分泌紊乱、脂类及糖类代谢紊乱等。衰老后一些老年病如动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、高血压病、神经变性疾病等的发生率明显增加。因此衰老将导致老年病的发生率增加、患病率提高。这些老年病将严重影响老年人群的健康，需要占用更多的医疗资源，给我国经济及生产力带来极大的冲击。因此延缓衰老对我国目前的发展具有重要意义。
　　 有关衰老机制的研究很多，目前已经深入到分子水平。如p16-INK4a被认为是一种细胞衰老的重要生物学标记，清除p16-INK4a阳性的细胞可以延缓衰老。细胞衰老涉及到多种复杂的生物分子机制，如能实现再生细胞代替衰老细胞，使细胞的再生和衰老实现均衡，延缓衰老有可能成为现实。1493-1541年，菲律宾Auredus Paracelsus首次提出细胞疗法，通过输入活细胞使机体获得年轻化，自20世纪50年代，全世界已经有数百万人接受细胞疗法。细胞疗法其中之一即是干细胞疗法。衰老进程中干细胞不断丢失，因此急时补充干细胞有可能延缓衰老。目前脂肪干细胞抗衰老已经初步应用于临床并取得确切疗效，骨髓间充干细胞等在动物实验组已被证实有抗衰老作用，目前血管内皮祖细胞(Endothelialprogenitor cells，EPCs)已经在急性心肌梗塞、难治性心绞痛、肢体缺血、慢性肝病等缺血性疾病的临床实验得到应用。Taguichi的临床试验证实血管内皮祖细胞不仅可以促进脑缺血部位的血管新生，维持血管内皮细胞的功能，还可以促进神经元的生长。以上组织和功能的恢复与血管内皮祖细胞分泌的内皮生长因子、胰岛素生长因子及纤维母细胞生长因子等有关。据研究报道胰岛素生长因子具有抗衰老的作用，而血管内皮祖细胞是否具有抗衰老作用，目前临床研究中尚未见到报道。
　　 目前应用于抗衰老评定的主要有抗氧化类物质、激素类、免疫功能及量表。自由基衰老理论认为细胞代谢产生的自由基，在人体衰老中起很重要的作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是体内自由基防御体系中最重要的酶类抗氧化剂，它可直接清除超氧阴离子自由基，阻断自由基连锁反应，保护组织免受超氧阴离子自由基的损伤，SOD活力的高低间接反应机体抗氧化的能力，即反应机体抗衰老能力;人体生长、发育与衰老主要受激素分泌水平的调节，激素分泌水平在不同的生理阶段发生不同的变化，IFG-1具有抗衰老作用，能反应机体衰老程度;衰老的免疫学假说认为免疫系统参加了脊椎动物的衰老过程，是衰老过程的主要调节系统之一，可以通过免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)测定免疫系统机能，随着衰老，血液中IgA、IgG升高，IgM降低;量表如衰老自测量表及匹兹堡睡眠量表评定可以测定机体机能状态;生理耗能指数(physiological index of energy consumption，PCI)亦能评定机体机能状态，PCI=（步行3min后心律-安静状态下的心律）(bts/min)/步行速度(m/min)。
　　 [目的]
　　 采用血液指表及量表评定观察输入自体血管内皮祖细胞的安全性及其在抗衰老方面的作用。
　　 [方法]
　　 2011-10至2012-10月在我院康复科选取4名受试者。入选患者:25岁＜年龄＜80岁;自愿配合治疗及随访;排除标准:孕妇、哺乳期患者及肿瘤病患，自身免疫性疾病，对青霉素等过敏，发热性疾病，肝肾呼吸系统疾病者。实验组2例（男1例45岁，女1例75岁），对照组2例（男1例49岁，女1例77岁）。实验组和对照组均行常规治疗（传统中医治疗及运动疗法），此外实验组进行自体EPCs移植。
　　 治疗方法:
　　 1.实验前实验组和对照组均进行血常规、血凝指标、尿常规、便常规、肝肾功、糖代谢指标、脂代谢指标、心衰指标、炎症指标、传染病八项定量相关检查，排除不能纳入临床研究的对象。
　　 2.血管内皮祖细胞获取实验组行骨髓穿刺:均选用髂前上棘抽取骨髓50ml左右，行干细胞培养。自体肱静脉外周血30ml，离心获得血清后冰冻保存以备混悬干细胞用。对照组无需行此操作。
　　 3.细胞培养及鉴定细胞培养严格在特定条件下进行，密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞。将骨髓单个核细胞以1×105/cm2接种于纤连蛋白包被的塑料培养瓶。特定培养液进行培养，培养4天后去除非粘附细胞。每周换液2次，细胞80％融合时进行传代。一般血液培养需一月左右可达到移植需求量(5×106/kg)，细胞培养后浓度及分离均由公司达到统一标准。专业公司进行端粒酶表达情况、表面标志、成品检定、存活率、内毒素、无菌检查、支原体、病毒外源因子、逆转录病毒、特殊人源病毒、细胞致瘤性、残余血清检测等。
　　 4.细胞移植细胞扩增到足够的数量后(5×106/kg)，进行移植。第一次移植，将2.5×106/kg个细胞，混悬于含5％自体血清的生理盐水100ml中，经桡静脉输入体内。输入过程中密切观察患者反应，如有不良反应时，急时停止输液。约1周后行第二次移植，移植的细胞数量同第一次。
　　 5.实验前及试验后第4个月采集受试者血液指标SOD、IFG-1、免疫球蛋白三项IgA、IgG、IgM，量表评定受试者衰老程度及睡眠质量，测定机体生理耗能指数。
　　 [疗效评定标准]
　　 1.超氧化物歧化酶(SOD)
　　 2.胰岛素样生长因子-1(IGF-1)
　　 3.免疫球蛋白三项IgA、IgG、IgM
　　 4.衰老自测量表（AAS）量表评定
　　 5.匹兹堡睡眠指数(PSQI)
　　 6.生理耗能指数(PCI)
　　 [统计学方法]
　　 暂无:本实验目前纳入受试对象共4例。预期采用SPSS13.0统计软件对实验结果进行统计学处理。
　　 [结果]
　　 1.超氧化物歧化酶(SOD)
　　 实验组两名受试者治疗后血液中超氧化物歧化酶歧化酶浓度较治疗前升高，对照组受试者治疗后较治疗前血液中SOD，Ⅲ降低，Ⅳ升高。
　　 2.胰岛素样生长因子-1(IGF-1)
　　 实验组两名受试者治疗后血液中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)较治疗前升高，对照组两名受试者治疗后血液中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)较治疗前变化不明显。
　　 3.免疫球蛋白IgA、IgG、IgM
　　 实验组两名受试者治疗后较治疗前血液中IgA、IgG降低，IgM升高，对照组两名受试者血液治疗后较治疗前血液中IgA、IgG下降，IgM无明显变化。
　　 4.衰老自测量表(AAS)量表评定
　　 实验组两名受试者治疗后较治疗前量表评定结果有明显降低;对照组两名患者治疗后较治疗前量表评定有降低，变化量较实验组小。
　　 5.匹兹堡睡眠量表(PSQI)量表
　　 实验组两名受试者治疗后较治疗前量表评定结果降低;对照组两名患者治疗后较治疗前量表评定降低。
　　 6.生理耗能指数(PCI)
　　 实验组两名受试者治疗后较治疗前量表评定结果有明显降低;对照组两名患者治疗后较治疗前量表评定有降低，变化量较实验组小。
　　 [结论]
　　 通过临床观察，输自体血管内皮祖细胞者的免疫系统功能，抗氧化能力，激素分泌水平，生理耗能指数及衰老自测水平等有改善。自体血管内皮祖细胞在治疗中安全可靠，治疗过程中及随访中未见免疫排斥反应及其它不良反应。自体血管内皮祖细胞将有可能成为抗衰老的一项新的研究课题。

目录

摘要

第一章 研究背景

第一节 抗衰老研究进展

1．衰老的分类

2．衰老学说

3．衰老目前评定方法

4．抗衰老目前治疗方案

第二节 干细胞抗衰老

1．干细胞抗衰老机制

2．目前实验证明具有抗衰老的干细胞

3．血管内皮祖细胞的临床应用及疗效观察

4．血管内皮祖细胞抗衰老作用

第二章 实验部分

第一节 资料与方法

1．研究对象

2．实验方法

3．观察指标

4．统计处理

第二节 结果

1．第四个月实验室检查结果

2．超氧化物歧化酶(SOD)

3．胰岛素样生长因子-1(IF-1)

4．免球蛋白三项

5．衰老自测量表

6．匹兹堡睡眠量表

7．生理耗能指数

第三节 讨论

全文总结

参考文献

英文缩写略词表

硕士在读期间发表论文情况

致谢

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