细菌脂蛋白耐受经RNA聚合酶ⅡS2磷酸化在转录水平上调控基因的差异表达

摘要

当机体受到细菌感染时，内源性免疫细胞通过模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)特异性识别病原微生物的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，如细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，细菌脂蛋白(bacterial lipoprotein，BLP)等，从而激活细胞信号转导通路，诱导基因表达，最终促发炎症并清除病原。然而内源性免疫细胞，特别是巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞释放的TNF-α，IL-1β和IL-6等促炎因子，往往会过度扩大炎症反应，加重疾病，甚至导致脓毒症患者的多器官功能衰竭。因此，有效抑制促炎细胞因子的过度释放，并同时维持免疫细胞的细菌杀灭能力，一直是病理生理学研究的重要课题。
　　 研究发现，在使用致死剂量LPS诱导小鼠脓毒症休克之前先给小鼠注射低于致死剂量的LPS，可以有效抑制小鼠体内促炎因子水平，小鼠死亡率显著下降，这种现象被称为LPS耐受。早期研究证实，LPS耐受的单核/巨噬细胞中TLR4信号通路受到抑制，因此认为LPS耐受的产生是由于细胞对LPS再次刺激失去应答能力。然而，最近Foster等人发现，在LPS耐受的小鼠巨噬细胞中，LPS诱导基因并不是全面地处于抑制状态，不同功能的基因可被LPS再刺激不同程度地诱导表达。并且这种功能相关基因的差异表达是通过转录水平上基因启动子处组蛋白4乙酰化(H4Ac)和组蛋白3第四位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)的差异修饰来调控的。
　　 BLP也可以诱导耐受。与LPS耐受相比，BLP耐受的小鼠不仅在致死剂量的BLP再刺激下可以有效存活，还可以对致死剂量的LPS产生交叉耐受。除了体内的TNF-α，IL-6等促炎因子分泌量明显降低以外，BLP耐受小鼠免疫细胞的表面细菌吞噬受体CR3和FcγR表达量明显上调，因此BLP耐受小鼠对细菌的识别，吞噬和细胞内杀灭能力均增强。细胞水平的研究发现，BLP耐受细胞中，BLP识别受体TLR2诱导的信号转导通路受到抑制，提示BLP耐受时，功能蛋白的表达差异可能是由于其基因的表达在转录水平上受到了不同的调控所导致。
　　 由此，本实验提出并且解决以下四个问题:1）BLP耐受过程中蛋白表达的差异是由其基因的表达差异所产生;2）这种差异表达是BLP耐受诱导的基因功能相关的再程序化，并且在TLR2信号通路受到广泛抑制的情况下，BLP耐受诱导基因的差异性表达是受转录水平的调控;3）BLP耐受与LPS耐受诱导的基因差异表达其调控机制不同，基因启动子处的组蛋白修饰在BLP耐受基因和BLP非耐受基因上并无差异;4）BLP耐受时不同功能相关基因的差异性表达是通过RNA PolⅡ S2磷酸化实现的，并且这种调控作用发生在基因转录时的最后一个外显子处。
　　 为了证明BLP耐受的细胞受到再次刺激后，BLP诱导基因是否在TLR2信号通路受到抑制的情况下呈现差异性表达，分别对正常的和BLP(100 ng/ml)耐受的小鼠骨髓巨噬细胞施以1，000 ng/ml BLP刺激，采用基因芯片技术，比较45,102个小鼠基因在正常和BLP耐受两种细胞中的表达情况。在施以1，000ng/ml BLP刺激的耐受细胞中，有1，196个基因因为细胞对BLP的耐受而受到抑制，我们把这类因为细胞对BLP耐受而受到抑制的基因称为耐受基因(tolerizeable genes，T genes);另外有1，058个基因在耐受细胞中反而表现出比正常细胞更强的表达能力，我们把这类基因称为非耐受基因(non-tolerizeablegenes，NTgenes)。
　　 为了研究BLP耐受时BLP诱导基因的差异性表达是否与基因功能相关，按照基因芯片结果中基因的表达变化倍数值从大到小的顺序，分别对耐受基因和非耐受基因进行排序，从两组基因中各选出表达量变化最为显著的100个基因，并根据这些基因的功能进行分类。参与BLP应答的基因在BLP耐受过程中变化最为显著的前100个基因的功能主要来自于促炎/血管激活，病原体识别/抗原递呈，抗炎及信号通路负调因子，干扰素应答，细胞趋化和迁移，以及代谢几个方面。
　　 对该分类结果进行统计，在非耐受基因组中，与病原体识别/抗原递呈相关的基因占其中的28％，而促炎/血管激活相关基因仅占8％。而在耐受基因组中情况则完全不同，促炎/血管激活基因占30％，病原体识别/抗原递呈相关基因的比例仅为6％。其他功能的基因在两组中分布比例基本相同，如抗炎及信号通路负调因子基因在两组中均为4％;干扰素应答基因在耐受基因组中占2％，在非耐受基因组中占4％;细胞趋化/迁移相关基因在耐受基因组中占8％，而在非耐受基因组中占4％;代谢基因在耐受基因组中占50％，而在非耐受基因组中占52％。说明BLP耐受时基因表达的特异性与基因的功能相关，具体表现为促炎/血管激活基因的广泛抑制和病原体识别/抗原递呈相关基因的持续表达。
　　 为了进一步研究BLP耐受过程中，功能相关的基因表达差异的调控机制，分别从促炎/血管激活相关基因中选取典型耐受基因，从病原体识别/抗原递呈相关基因中选取典型非耐受基因，用Realtime-qPCR的方法进一步确认两组基因在mRNA水平上存在差别。耐受基因Il12b(T=20.95, p＜0.010)，Cc120(T=50.98, p＜0.001)，Cc122(T=86.24, p＜0.001)在正常细胞受到1，000 ng/ml BLP刺激4hh后显著升高，而在BLP耐受细胞中三个基因均没有表现出因刺激而表达量升高，而是呈现明显的抑制状态。非耐受基因Mmp8(T=17.49, p＜0.001)，Cd209f(T=8.944, p＜0.010)以及Cd209g(T=17.21，p＜0.010)的表达情况与耐受基因完全不同。在正常细胞受到1，000 ng/ml BLP再刺激后呈现低至中量表达，而在BLP耐受细胞中三种基因的表达量非但没有受到抑制，反而显著升高。
　　 为了证明BLP耐受过程中，耐受基因和非耐受基因在mRNA水平上的差异是由于基因的不同表达模式所造成的，我们进一步验证了耐受和非耐受基因的动力学表达。正常细胞受到100 ng/ml的BLP刺激后，耐受基因Il12b和Cc120即被激活，细胞内其mRNA水平在3hh左右累积达到高峰，并在24h后降解至本底水平，说明此时细胞已经形成耐受状态。在BLP耐受基础上再施以1，000 ng/ml的BLP刺激，耐受基因Il12b在此后的27hh内维持在本底水平(T=111.4, p＜0.001)，而耐受基因Cc120虽然在受到大剂量BLP刺激后的3h左右再次达到高峰，然而峰值却显著低于正常细胞受诱导后所产生的mRNA水平(T=16.92, p＜0.010)。与耐受基因相比，非耐受基因则呈现出截然不同的动力学表达过程。在细胞受到小剂量BLP(100 ng/ml)刺激后，Mmp8和Cd209f产生了低至中量的表达。但是值得注意的是，在BLP耐受基础上再施以大剂量BLP(1，000 ng/ml)刺激后，非耐受基因mRNA水平持续累积升高，并且在同时期内Mmp8(T=13.85, p＜0.010)和Cd209f(T=102.2，p＜0.001)显著高于正常细胞受到大剂量BLP刺激时所产生的mRNA水平。
　　 在BLP耐受过程中，造成耐受基因和非耐受基因表达方式上的差异有两种可能，其一是由于mRNA稳定性的差异——非耐受基因的mRNA稳定性普遍较高，在首次刺激后较长时间内，其细胞内水平维持较高水平，而耐受基因稳定性较低，在首次刺激后较短时间内mRNA迅速降低恢复本底水平。另外一种可能是，耐受基因和非耐受基因的表达在转录水平受到不同的调控，即在首次BLP刺激后，耐受基因的转录受到抑制因而无法在受到二次刺激后被再度激活产生mRNA，而非耐受基因的转录仍然处于可诱导转录状态，因此可被再度诱导表达。
　　 为了验证上述耐受基因和非耐受基因其表达动力学上的差异，是否是由于两种类型基因的mRNA稳定性不同所导致，在小鼠骨髓巨噬细胞用1，000 ng/ml的BLP诱导4h后，加入转录抑制剂Actinomycin D(ActD)，在接下来的4h中观察细胞内两组基因的mRNA水平。结果证实两种类型基因的mRNA降解均较为迅速，降解率在两h内达到50％左右。因此，两组基因mRNA的稳定性既不足以造成两组基因表达动力学上的差异，也无法在受到小剂量BLP预处理24h后继续维持非耐受基因在细胞内的高mRNA水平。由此说明BLP耐受时基因表达模式的差异并不是由于基因mRNA稳定性的不同所导致。
　　 为了验证BLP耐受时基因特异性的转录调控是否与LPS耐受依赖同样的机制，即H4Ac和H3K4me3。我们首先采用染色质免疫共沉淀技术检测BLP耐受细胞中，基因启动子处的H4Ac水平。BLP(100 ng/ml)耐受细胞中两组基因的乙酰化水平均显著高于正常细胞(p＜0.010)，说明小剂量BLP的持续刺激可使BLP诱导基因启动子处的乙酰化水平持续升高。但是在BLP耐受基因和非耐受基因之间并不存在差异。为了证实这一结果，我们进一步采用特异性去乙酰化酶抑制剂trichostatin A(TSA)抑制组蛋白去乙酰化，比较两组基因在正常细胞和BLP耐受细胞中的表达情况。虽然加入去乙酰化酶抑制剂后两组基因表达水平均有所变化，但耐受基因Il12b和Cc120在BLP耐受细胞中的抑制状态并未因受到去乙酰化抑制剂的影响而得到逆转，耐受基因的表达依然受到抑制(p＜0.010)。说明BLP诱导基因在BLP耐受细胞中的差异性表达调控并不依赖于基因启动子处H4Ac的调控。
　　 为检测BLP耐受和非耐受基因启动子处的H3K4me3水平。在正常细胞和BLP(100 ng/ml)耐受细胞受到大剂量(1，000 ng/ml) BLP刺激后，在耐受基因Il12b，Cc120和非耐受基因Cd209f，Mmp8启动子处均未检测到组蛋白3第四位赖氨酸三甲基化水平的显著升高，说明H3K4me3并未发生在小鼠骨髓巨噬细胞对BLP应答的过程中。利用特异性去甲基化酶抑制剂pargyline(Parg)抑制染色质的去甲基化后，也未能恢复耐受基因在BLP耐受细胞中的表达。说明BLP诱导基因在BLP耐受细胞中的差异性表达调控也不依赖于基因启动子处H3K4me3的调控。
　　 除了基因启动子组蛋白修饰之外，RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNA PolⅡ)的碳端丝氨酸2(serine2，S2)磷酸化也是基因转录过程中重要的调控机制。通常认为，RNA PolⅡ在转录开始大约50个碱基处受到S2磷酸化的调控。RNA PolⅡ启动转录大约50个碱基后并不进入延伸状态，只有当S2被磷酸化后才能够继续进行延伸。最近又有实验证实，RNA PolⅡ S2的磷酸化是发生在完成延伸之后。在细胞没有受到刺激的情况下，RNA PolⅡ就出现在很多一级应答基因上。这时的RNA PolⅡ可以合成全长的RNA转录本，但是由于其S2没有被磷酸化而不具备剪切和加工的功能，因此不能产生成熟有效的mRNA，而合成的全长RNA转录本只是为了维持基因的开放型结构，以便对随时可能来临的刺激作出快速应答。当细胞受到刺激，如LPS后，RNA PolⅡ在转录延伸因子P-TEFb的作用下S2被磷酸化，从而获得剪切的活性，将全长RNA加工成为成熟的mRNA转录本。然而，关于RNA PolⅡ S2的磷酸化发生于延伸前期还是后期目前尚无定论。
　　 因此我们设想在BLP耐受的细胞中，BLP诱导基因的不同转录模式是由于RNA PolⅡ S2的磷酸化受到不同的调控造成的。为验证该假设，我们分别检验耐受基因和非耐受基因转录延伸的前期，第二个外显子(exon2，E2)和延伸后期，最后一个外显子(the last exon，En)处RNA PolⅡ S2磷酸化水平的差异。
　　 正常细胞受到1，000 ng/ml BLP刺激后，在耐受基因I112b E2处RNA PolⅡS2的磷酸化于1h达到较高水平，在4h时依然显著高于本底水平(T=20.91，p＜0.010)。而在BLP(100 ng/ml)耐受细胞中，Il12b基因E2处的RNA PolⅡ在大剂量BLP(1，000 ng/ml)再刺激1h后其S2磷酸化水平明显低于正常细胞同时期的水平(T=9.893，p＜0.010)。但是与设想不同的是，在大剂量BLP再刺激4h后，RNA PolⅡ S2的磷酸化水平继续显著上升，并没有受到明显抑制(p＜0.050)。而非耐受基因Mmp8在正常细胞中，BLP刺激1h后RNA PolⅡ的S2磷酸化水平达到高峰，4h后仍然维持高度磷酸化状态(T=28.52, p＜0.001)。而在BLP(100 ng/ml)耐受细胞中，大剂量BLP(1，000 ng/ml)再刺激后，Mmp8基因E2处的RNA PolⅡ S2磷酸化在刺激后1h处有小量升高，而在刺激后4h其磷酸化水平显著升高(T=27.69, p＜0.001)。
　　 我们进一步比较了两组基因En处的RNA PolⅡ S2磷酸化水平，实验结果发现在正常细胞中，耐受基因Il12b在受到BLP刺激4h时En处的RNA PolⅡS2磷酸化水平明显升高(T=10.59, p＜0.010)，而在BLP(100 ng/ml)耐受细胞受到1，000 ng/ml BLP刺激4h后，RNA PolⅡ S2磷酸化在Il12b基因的En处仍被抑制在本底水平。而非耐受基因Mmp8在正常细胞和BLP耐受细胞受到1，000ng/ml BLP刺激4h后，在其En处均检出S2高度磷酸化的RNA PolⅡ(T=13.46,p＜0.010)。
　　 综上所述，BLP耐受细胞中BLP可诱导基因根据其基因功能的不同产生了再程序化，从而表现为耐受基因和非耐受基因。并且，耐受基因和非耐受基因差异表达的调控机制存在于转录水平。与LPS耐受诱导的基因特异性表达调控机制不同，BLP耐受诱导的基因特异性表达调控并不依赖于基因启动子处的组蛋白修饰，而是通过在基因转录的延伸过程中，抑制RNA PolⅡ S2在耐受基因最后一个外显子处的磷酸化，同时保持RNA PolⅡ S2在非耐受基因最后一个外显子处再次被诱导磷酸化而实现的。该结果提示，通过对RNA PolⅡ S2磷酸化进行干预，在体内抑制BLP诱导促炎基因的过度表达避免炎症反应的过度放大，同时维持甚至增强病原识别相关基因的表达以清除细菌病原体感染，防止脓毒症和脓毒症休克的发生发展。

目录

摘要

前言

1 炎症反应

1．1 炎症反应在细胞水平上的研究

1．2 细胞信号转导通路的研究

1．3 转录水平上的调控机制

2 LPS耐受

2．1 MyD88和TRIF通路的不同调控

2．2 TLR信号通路的负调控子

2．3 NF-κB在炎症细胞和LPS耐受中的可塑性

2．4 LPS耐受时的染色质修饰和基因重构

3 BLP诱导的耐受和交叉耐受

3．1 细胞表面受体的变化

3．2 细胞内信号通路蛋白的变化

3．3 细胞耐受时的NF-κB

3．4 革兰氏阳性菌耐受后细胞吞噬能力增加

4 小结

材料方法

1 材料

2 方法

结果

1 基因芯片，功能分类，以及代表性基因的Real-time-qPCR验证

2 基因的表达动力学以及mRNA稳定性

3 启动子处组蛋白甲基化和乙酰化实验与甲基化和乙酰化的抑制实验

4 RNA Pol Ⅱ S2在第2和最后一个外显子处的招募及磷酸化

讨论

参考文献

成果

致谢

统计学审稿证明

声明