APP基因调控AML1/ETO+白血病细胞迁移及其分子机制研究

摘要

背景和目的：
　　 白血病是一种累及造血干/祖细胞的恶性肿瘤，在我国发病率为417/10万，在肿瘤中居第七位，死亡率极高。随着化疗方案的不断改进，白血病的诱导缓解率有了明显提高，但复发率仍高达30％-40％。究其原因，白血病髓外浸润导致的复发是引起死亡的重要原因之一。
　　 伴t(8;21)(q22;q22)和AML1/ETO急性髓系白血病(acute myeloidleukemia，AML)占AML的12％。国外学者认为AML1/ETO+是预后良好的因素，其缓解率高达98％，5年生存率可达69％[3-5];而我国学者认为，该类型白血病异质性大，尤其是合并髓外浸润者预后差[6]。髓外白血病在AML1/ETO+白血病中尤为多件，但缺乏理想的防治方法，发生机制也了解得太少。我们课题组前期临床研究发现，在急性白血病伴AML1/ETO+患者中，APP基因高表达者的髓外白血病发生率显著高于低表达者，总生存时间和无复发生存时间比低表达患者显著缩短，具有统计学差异。进一步利用QRT-PCR等技术检测APP基因在急性髓系白血病细胞株kasumi-1、HL-60、HL-60/ADM、U937中的表达，结果显示APP基因在kasumi-1细胞中表达最高。因此，本课题研究以kasumi-1细胞为研究对象，构建干扰APP表达的慢病毒载体，稳定转染kasumi-1细胞，研究其在白血病细胞中生物学功能及探讨APP基因参与白血病髓外浸润的作用机制，为防治髓外白血病的发生发展和治疗方法提供理论依据。
　　 内容和方法
　　 1.验证kasumi-1细胞符合AML1/ETO+-AML的细胞模型应用瑞氏-吉姆萨染色和过氧化物酶染色检测kasumi-1细胞符合急性髓系白血病细胞的形态特征;应用流式细胞术检测kasumi-1细胞表面的分子标记;利用FISH和染色体核型分析验证kasumi-1细胞具有t(8;21)核型和AML1/ETO+遗传学特征。
　　 2.构建质粒载体，包装病毒转染目的细胞根据siRNA设计原则，针对APP目的基因所有转录本共同区域的3个靶点设计3条shRNA序列，即siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3。构建靶向APP的shRNA慢病毒干扰载体，稳定干扰高表达APP基因的白血病细胞株kasumi-1。利用流式细胞术分选出GFP阳性细胞，体外扩增培养。应用荧光定量PCR和Western-Blot技术检测3对siRNA/APP对kasumi-1细胞的干扰效果，选取干扰效果最好的细胞作为siAPP实验组用于后续实验研究。
　　 3.APP基因对白血病细胞功能的研究
　　 (1)实验分组:野生型组(wild)、转染scramble序列的对照组(NC)、转染干扰APP基因序列组(siAPP)。
　　 (2)验证干扰效果荧光定量PCR和Western-Blot技术检测上述三组细胞APP mRNA和蛋白的表达，明确干扰效果。
　　 (3)抑制APP基因的表达对白血病细胞生物学特性的影响利用CCK-8法、流式细胞术、Transwell小室迁移实验等观察APP表达抑制后细胞增殖、凋亡及迁移能力的变化。进一步明确APP基因在白血病细胞中的生物学功能。
　　 4.APP介导的分子基础初步研究利用荧光定量PCR和Western-Blot技术检测与细胞转移相关的分子，如CXCR4、MMP-2、MMP-9、ERK和c-Myc的表达，寻求APP介导kasumi-1细胞髓外浸润相关的分子信号转导机制。
　　 5.统计学分析:
　　 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，资料(x)±s描述，以p＜0.05认为具有统计学差异;Levene检验方差齐性，若方差齐使用LSD方法进行多重比较，若方差不齐则使用采用近似F检验（Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett's T3方法进行多重比较。
　　 结果:
　　 1.kasumi-1细胞的遗传学特征
　　 (1) PCR和WB检测白血病细胞APP的表达水平应用单因素方差分析APP mRNA在kasumi-1、HL60和U937三种AML细胞株中的表达分别为0.1810±0.0077、0.1319±0.0068和0.0380±0.0049，其中kasumi-1细胞APP mRNA的表达量最高。Levene方差齐性检验F=0.481，p=0.640;单因素方差分析结果显示F=300.989，P=0.000;应用LSD法进行多重比较，kasumi-1与HL60比较，kasumi-1与U937比较，HL60与U937比较，P值均为0.000。Western-Blot结果与PCR一致，其中kasumi-1条带颜色最深，U937条带颜色最浅。
　　 (2) kasumi-1细胞符合髓系白血病的形态学特征瑞士染色显微镜下观察可见大量幼稚细胞，胞核大，胞浆较少，胞核内可见颜色较深染色质颗粒;过氧化物酶染色显示，细胞浆中可见棕褐色物质沉积，为过氧化物酶染色阳性。因此，形态学结果提示kasumi-1细胞属于髓系白血病细胞株。
　　 (3) kasumi-1细胞遗传学特征荧光原位杂交技术(FISH)检测显示，kasumi-1细胞具有较强的AML1/ETO融合信号，且AML1/ETO融合基因阳性细胞占96％。
　　 2.染色体核型分析结果显示该细胞染色体核型为79，XX，t(8;21)，此外，还同时伴有数目异常和2p-、7q-、5q-、13q+、1-3mar等异常。0.0144±0.0003，0.0047±0.0007，0.5778±0.0009。Levene方差齐性检验，F=2.860，p=0.134，说明方差齐;应用LSD进行多重比较，各组间进行两两比较p值均为0.000，其中siRNA-2组细胞APP mRNA表达量最低。Western-Blot结果显示siRNA-2干扰的细胞APP蛋白条带的表达量最低，与PCR结果一致。因此，后续实验选取siRNA-2序列病毒转染的kasumi-1细胞作为实验干扰组，及siAPP组。
　　 我们选取野生型组kasumi-1细胞为空白对照(wild)、转染scrmble序列的病毒为阴性对照(NC)，利用PCR和western-Blot技术检测siRNA/APP对APP的干扰效果。QRT-PCR检测结果显示，wild组、NC组和siAPP组细胞APP mRNA相对表达量分别为0.1265±0.0053、0.1230±0.0030和0.0049±0.0006。Levene方差齐性检验，F=3.026，P=0.123;单因素方差分析结果显示，F=1146.989，p=0.000，应用LSD法进行组间多重比较，wild组和NC组无统计学差异(p=0.271)，siAPP组分别与wild组和NC组比较，p值均为0.000。 Western-Blot结果显示siAPP组APP蛋白条带明显减少，NC组和wild组条带无明显差异。说明siRNA能够成功干扰APP的表达。
　　 3.APP基因在kasumi-1白血病细胞中的生物学功能
　　 (1)干扰APP的表达对凋亡的影响应用流式细胞术检测各组细胞早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例，结果显示:Wild组、NC组和siAPP组早期凋亡比例分别为21.43±0.86、21.67±0.78和29.00±0.98。 Levene方差齐性检验，F=0.135，P=0.876;单因素方差分析显示，F=71.927，p=0.000，应用LSD法进行组间两两比较，siAPP组分别与wild组和NC组比较，p值均为0.000，具有统计学差异;wild组和NC组比较，p=0.756，差异不具有统计学意义。Wild组、NC组和siAPP组晚期凋亡比例分别为12.33±0.75、12.90±1.25和19.80±1.51。Levene方差齐性检验，F=0.600，P=0.579;单因素方差分析显示，F=35.239，p=0.000，应用LSD法进行组间两两比较，siAPP组分别与wild组和NC组比较，p值均为0.000，具有统计学差异;wild组和NC组比较，p=0.588，差异不具有统计学意义，说明干扰APP表达后细胞的晚期凋亡率显著增加。
　　 (2)干扰APP的表达对kasumi-1细胞周期的影响采用流式细胞术分析wild、NC和siAPP三组kasumi-1细胞的细胞周期分布。Wild组细胞G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为36.97±9.12、26.03±5.20和34.93±2.80; NC组细胞G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为36.40±8.17、26.27±4.86和34.80±7.56; siAPP组细胞G0/G1期、S期和G2/M期的比例分别为36.63±3.90、28.37±6.27和33.17±2.42。
　　 Levene方差齐性检验各组细胞G0/G1期，F=1.252，P=0.351，单因素方差分析显示F=0.004，P=0.996，应用LSD法进行多重比较，siAPP组与wild组比较p=0.958，siAPP组和NC组比较，p=0.971，wild组与NC组比较，p=0.929，说明G0/G1期各组细胞无统计学差异。
　　 Levene方差齐性检验各组细胞S期，F=0.063，P=0.939，单因素方差分析显示F=0.165，P=0.851，应用LSD法进行多重比较，siAPP组与wild组比较p=0.620，siAPP组和NC组比较，p=0.655，wild组与NC组比较，p=0.960，说明S期各组细胞无统计学差异。
　　 Levene方差齐性检验各组细胞G2/M期，F=4.654，P=0.060，单因素方差分析显示F=0.123，P=0.887，应用LSD法进行多重比较，siAPP组与wild组比较p=0.672，siAPP组和NC组比较，p=0.695，wild组与NC组比较，p=0.974，说明G2/M期各组细胞无统计学差异。
　　 (3)干扰APP表达对细胞体外迁移运动能力的影响采用Transwell小室检测沉默APP表达后细胞体外迁移运动能力的变化，显微镜下观察siAPP组下室细胞密度显著减少，进行计数并计算细胞迁移率。Levene方差齐性检验F=1.642，P=0.270，单因素方差分析显示，F=16.107，p=0.004，应用LSD法进行组间重复比较，siAPP组分别与NC组和wild组比较，p值分别为0.002和0.003，NC组和wild组比较，p=0.641。将Transwell膜进行染色后，显微镜下200倍视野观察发现，siAPP组膜上细胞较对照组显著减少，随机选取5个视野计数，Levene方差齐性检验F=0.379，P=0.692，单因素方差分析显示，F=66.650，p=0.000，应用LSD法进行组间重复比较，siAPP组分别与NC组和wild组比较，p值均为0.000，NC组和wild组比较，p=0.936，说明APP沉默表达后细胞的迁移运动能力显著降低。
　　 (4)干扰APP表达对kasumi-1细胞增殖的影响应用CCK-8法检测干扰APP表达后细胞增殖能力的变化，观察24h、48h、72h和96h，结果发现各组细胞的OD值无明显变化，不具有统计学差异(p＞0.05)。绘制生长曲线可见，三组细胞的生长曲线汇聚，无显著差异。说明沉默APP表达对kasumi-1细胞的增殖无影响。
　　 (5)干扰APP表达对kasumi-1细胞结构的变化采用扫描电子显微镜进一步研究APP对kasumi-1细胞膜结构的影响，扫描电镜观察发现NC组细胞膜表面具有丰富的微绒毛，且微绒毛较为粗壮，微绒毛游离端膨大，形成钝圆形轮廓。干扰APP的表达后，siAPP组细胞膜表面微绒毛数量显著减少，且微绒毛形态细长、尖头。
　　 4.APP介导的分子基础初步研究
　　 (1) PCR和WB检测MMP-2、MMP-9和CXCR4的表达以β-actin为内参，根据扩增曲线得到各样本MMP-2、MMP-9和CXCR4的Ct值，计算每个样本的△Ct值，运用2-△Ct法分别计算各组细胞中MMP-2、MMP-9和CXCR4的相对表达水平。结果表明，MMP-2在wild组、NC组和siAPP组细胞中的表达分别为0.1570±0.0317、0.1736±0.0462和0.0062±0.0013，Levene检验显示方差不齐，F=7.283，p=0.025，故选择方差不齐的近似F检验Welch法，F=73.359，p=0.005，具有统计学差异。采用Dunnett's T3进行组间多重比较，结果显示，siAPP组分别与NC组比较，p=0.001;siAPP组和wild组比较，p=0.000，均具有统计学差异;wild组和NC组比较，p=0.996，不具有统计学差异。
　　 MMP-9在wild组、NC组和siAPP组细胞中的表达分别为(2.8800±0.2883)×10-7、(2.6833±0.7862)×10-7和(4.9433±1.9388)×10-7。Levene检验方差齐，F=2.691，P=0.146，单因素方差分析显示，F=3.163，p=0.115;应用LSD法进行多重比较，siAPP组与wild组p=0.084，siAPP组与NC组p=0.064，NC组与wild组p=0.850。说明各组间无统计学差异，且MMP-9在各组细胞中的表达量很低。
　　 CXCR4在wild组、NC组和siAPP组细胞中的表达分别为0.2391±0.0195、0.2280±0.0693和0.1744±0.0567。Levene检验方差齐，F=3.375，P=0.104，单因素方差分析显示，F=1.283，p=0.344;应用LSD法进行多重比较，siAPP组与wild组p=0.185，siAPP组与NC组p=0.261，NC组与wild组p=0.807。APP在wild组、NC组和siAPP组细胞中的表达分别为0.1175±0.0406、0.1035±0.0283和0.0075±0.0012，Levene检验方差齐，F=3.461，P=0.100，单因素方差分析显示，F=13.164，p=0.006;应用LSD法进行多重比较，siAPP组与wild组p=0.003，siAPP组与NC组p=0.006，NC组与wild组p=0.571。
　　 以β-actin为内参，30ug蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，根据蛋白条带图可见，siAPP组MMP-2蛋白的表达水平显著降低，CXCR4的蛋白表达未见明显改变。
　　 (2) WB检测MAPK信号转导通路以GAPDH为内参，50ug蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，蛋白条带结果显示，干扰APP表达后，细胞p-ERK和c-Myc蛋白的表达水平也显著降低，ERK的蛋白表达未见明显改变，因此我们推测APP通过p-ERK/c-Myc/MMP-2的信号途径介导白血病细胞髓外浸润的发生发展。
　　 结论：
　　 1.kasumi-1细胞具有t(8;21)染色体核型及AML1/ETO+的遗传学特征，符合髓系白血病细胞的特点;同时高表达APP基因。
　　 2.RNAi技术成功干扰kasumi-1细胞APP基因的表达，并获得稳定转染的细胞株。
　　 3.干扰APP的表达后的kasumi-1细胞运动迁移能力显著降低，细胞凋亡增加，对细胞周期及细胞增殖无显著影响。
　　 4.证明了APP/p-ERK/c-Myc/MMP-2通路能够调控AML1/ETO+白血病细胞的迁移力。

目录

摘要

前言

第一章 kasumi-1细胞的生物学特征

一、材料和方法

二、统计学分析

三、结果

四、讨论

第二章 构建稳定转染siAPP基因表达的kasumi-1细胞模型

一、材料和方法

二、统计学分析

三、结果

四、讨论

第三章 siAPP基因表达对kasumi-1细胞生物学行为的影响

一、材料与方法

二、统计学分析

三、结果

四、讨论

第四章 APP／ERK／MMP-2通路调控kasumi-1白血病细胞迁移的机制

一 材料和方法

二 统计分析

三 结果

四、讨论

参考文献

全文小结

缩略词中英文对照表

攻读博士学位期间撰写的论文

致谢

声明

统计学审稿证明