TGFβ1-ILK下游信号分子及C-C类趋化因子在慢性移植肾失功发病机制中的作用及其意义的研究

摘要

背景:
　　 肾间质纤维化是各种肾脏损伤进展的共同终末阶段，其过程包涵肾小管上皮细胞的减少、成纤维细胞的聚集、肾小管上皮细胞转分化以及细胞外基质的积聚，最终导致肾间质纤维化的发生，肾脏功能不可逆性损伤，进展为尿毒症阶段。
　　 持续性血液透析和肾移植是目前终末期肾脏疾病的主要替代疗法，相对于持续性血液透析治疗，肾移植不仅可以很好的提高患者的生活质量还可以延长患者生存时间。全国每年有超过100万的慢性肾脏衰竭患者等待移植，但是器官来源短缺的形势仍然严峻，能够得到肾移植的患者每年不足1万例。随着新型免疫抑制剂的广泛应用以及配型技术的不断完善，肾移植术后早期发生急性排斥反应发生率明显下降，肾移植术后1年存活率和5年存活率得到明显提高，分别达到90％、70％;然而移植肾的10存活率仍然停留在50％左右并未得到明显改善;患者最终仍然要面临第二次肾移植或者继续行维持性血液透析治疗。如何提高移植肾的长期成活，提高患者的生存质量，延长移植术后患者重新进入二次移植成为困扰医学界的一道难题。研究发现，影响远期移植肾功能的主要因素是慢性移植肾失功(chronic renal allograft dysfunction，CRAD)，超过50％的移植肾功能进行性衰竭是由于CRAD引起的，因而有效的预防和早期治疗CRAD是当前提高移植肾长期存活的主要目标之一。CRAD临床上主要表现为无明显诱因的出现血肌酐进行性升高、持续性蛋白尿、高血压，最终进展为终末期肾病。肾间质纤维化/小管萎缩、肾小球硬化及移植肾血管病变是CRAD主要病变特征，以上病变与移植肾间质中单个核细胞和肥大细胞浸润有关。单个核细胞被激活后释放多种细胞因子的促炎因子介导炎症细胞在肾间质的浸润，引起肾小管上皮细胞分泌过量的细胞外基质，导致了细胞外基质合成和分泌的失衡进一步引起异常积聚，最终导致肾间质的纤维化。既往研究已经证明慢性炎性细胞在肾间质的浸润是各种肾脏疾病中肾单位损伤的关键病理过程，包括慢性移植肾失功。
　　 TGFβ1-ILK信号通过的下游信号分子PKB/Akt、GSK-3β在慢性移植肾失功间质纤维化及小管萎缩的发病机制中同样发挥着重要作用;多种生长因子及细胞趋化因子均可通过PKB/Akt信号通路发挥作用，磷酸化蛋白激酶B的ser473位点可以使其激活，激活后的p-Akt参与调节细胞的生长、分化及凋亡的过程。研究表明TGF-β1及ILK均可以通过磷酸化蛋白激酶B的ser473位点的丝氨酸，使其激活进而促进细胞增殖，减少细胞凋亡;磷酸化的PKB/Akt在肾小管EMT过程中发挥重要作用，磷酸化的PKB/Akt进一步作用于下游的信号分子GSK-3β，研究证实GSK-3β在慢性移植肾肾病中调控着炎症反应的发生，其在受损肾小管中表达显著，磷酸化的GSK-3β（失活状态）的表达与肾小管间质纤维化/小管萎缩呈负相关。
　　 最近的研究揭示C-C族趋化因子如单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及调节正常T细胞表达和分泌因子(Regulated up activation，normal T cells expressed andsecreted factor，RANTES)对淋巴细胞和巨噬细胞均有强烈的趋化作用，二者介导的炎性反应与移植肾功能的恶化相关，但其确切的机制仍未完全阐明。MCP-1和RANTES分别通过与细胞表面的CCR2及CCR5受体结合，发挥作用。MCP-1和RANTES可以调节多种细胞反应，如细胞生长、分化、程序性死亡和炎性反应。
　　 肾脏纤维化是一个复杂的过程，到目前为止其机制仍不十分明确，因而有必要进一步研究肾移植术后CRAD所致纤维化的发病机制，为治疗和干预CRAD的发生发展提供基础理论研究和检测方法。
　　 目的:
　　 观察单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、调节正常T淋巴细胞生成和分泌因子(RANTES)在CRAD移植肾组织中的表达;探讨MCP-1和RANTES在移植肾间质纤维化/小管萎缩中的作用。观察蛋白激酶B(PKB/Akt)、糖原合成激酶-3β的表达与整合素链接激酶（integrin-linked kinase，ILK）、转分化生长因子-β1(TGF-β1)、E-钙蛋白（E-cadherin）、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达关系;探讨PKB/Akt和GSK-3β在肾小管上皮细胞转分化中的作用，进一步阐明移植肾纤维化的分子病理机制，为临床防治慢性移植肾失功提供相应的理论和新的思路。
　　 方法:
　　 1、病例入选标准:(1)肾移植术后6个月出现不明原因的血肌酐异常升高＞130umol/L;(2)血肌酐升高后予以甲泼尼龙500mg/L，静脉滴注，连续3天冲击治疗后，肌酐无明显降低者，排除急性排斥反应;(3)彩超提示排除输尿管梗阻（结石、肿瘤等）及移植肾动脉狭窄;(4)钙调神经抑制剂（环孢素、他克莫司）浓度未见异常;(5)T淋巴细胞亚群检测未见淋巴细胞明显升高;(6)移植肾病理显示:慢性间质损伤的形态学改变如:肾小管周围毛细血管基底膜增厚、伴有间质纤维化/小管萎缩，肾小球基底膜增厚呈双轨征;动脉内膜增厚。
　　 2、临床资料:收集既往在我院行肾移植术，并于2009年01月至2011年01月因肌酐进行性升高或顽固性蛋白尿而行移植肾穿刺活检术的肾穿标本，其中符合慢性移植肾失功的有32例，包括19例男性（44±7岁），13例女性(45±4岁)，肾穿时间为肾移植术后1-9年，平均3.6年，血肌酐为（328±162）umol/L，其中21例是接受环孢素+吗替麦考酚酯+泼尼松三联免疫抑制治疗方案，11例接受他克莫司+吗替麦考酚酯+泼尼松三联免疫抑制治疗方案。所有患者供受者血型相同，HLA A、B、Dr位点至少有两个位点相配，淋巴度试验＜10％，PRA（群体反应性抗体）阴性。以6例正常肾组织作为对照组，均为正常供体尸肾术前穿刺活检标本，病理检查无异常。
　　 3、研究方法:所有标本采用免疫组织化学EnVision二步法检测移植肾组织中MCP-1、RANTES、GSK-3β、p-Akt、ILK、TGF-β1、E-cadherin、a-SMA的表达，按照最新Banff2009移植肾病理分级标准[1]，依据移植肾间质纤维化/小管(IF/TA)萎缩的严重程度分为:(1)Ⅰ级轻度间质纤维化和肾小管萎缩(＜25％的皮质受累);(2)Ⅱ级中度间质纤维化和肾小管萎缩（26％～50％的皮质受累）;(3)Ⅲ级重度间质纤维化和肾小管萎缩（＞50％的皮质受累）。肾小管间质炎症细胞浸润情况分为轻度、中度和重度。轻度;少量炎症细胞浸润，呈散在分布;中度:局灶性炎症细胞浸润;重度:大片、弥漫状炎症细胞浸润。采用德国Leica（DMR+Q550型）真彩色病理图像分析系统对染色结果进行半定量分析，随机选取10个不连续（避开肾小球和大血管）的肾小管间质视野(×400，HPF)，观察部位包括肾皮质、皮髓交接处和髓质部的肾小管间质，每例肾小管总数大于60个，测定视野中肾小管间质阳性表达面积与视野内肾小管间质总面积（去除肾小管管腔）的比值，取其均值代表此例患者某种成分在肾小管和间质的相对含量。
　　 统计分析:
　　 所有数据均以均数±标准差(X±S)表示，应用SPSS13.0统计分析软件，oneway ANOVA方法，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnett's T3法，两变量相关性分析采用Spearman线形相关分析，p＜0.05有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、移植肾组织学改变主要表现为肾间质局灶性或弥漫性纤维化和小管萎缩伴有单核细胞浸润，部分小管扩张;肾小球基底膜增厚，呈双轨征改变，部分小球呈节段性硬化;肾小球系膜区增宽，部分系膜细胞溶解;肾小管周围毛细血管基底膜增厚;动脉内膜增厚。不符合急性排斥反应、钙调神经抑制剂肾毒性损伤、输尿管梗阻/反流等其他疾病病理改变。
　　 2、肾小管间质中信号分子的表达
　　 2.1 p-AN、GSK-3β、ILK、TGF-β1、E-cadherin和α-SMA的表达正常肾组织中肾小管上皮细胞p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1表达微弱，CRAD反应患者移植肾组织中p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1表达明显增加，染色主要位于肾小管上皮细胞和间质细胞胞浆中且随着IF/TA病理分级程度的加重表达呈增高趋势，萎缩变性的肾小管表达最为强烈。肾间质细胞中亦可见到p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1表达。间质病变越重，表达量越多，范围越广。E-cadherin在正常对照组肾组织中的小球和小管的上皮细胞的胞膜上有大量表达，胞浆中有少量表达;在移植肾组织IF/TAⅠ级病变组中，E-cadherin的表达开始减少;Ⅱ级组表达明显减少，Ⅲ级组中仅见少量表达。
　　 正常对照组肾组织中，α-SMA仅表达于血管平滑肌肌层，在肾间质偶有表达。移植组中，随肾间质病变加重表达增强。IF/TAⅡ级和Ⅲ级病变广泛分布于间质区域，一些管腔破坏和萎缩的肾小管上皮细胞胞浆也可见表达。
　　 2.2 MCP-1和RANTES在肾小管间质中的表达CRAD患者移植肾组织中MCP-1表达明显，主要位于肾小球系膜区、肾小管细胞包浆及毛细血管袢内皮侧，正常肾组织中MCP-1的主要表达主要见于肾小管上皮细胞，MCP-1的表达随着炎症细胞浸润程度及间质纤维化/小管萎缩程度的加重而增多，具有正相关。CRAD患者移植肾组织中RANTES大量表达于肾小管上皮细胞、浸润于肾间质的单核巨噬细胞及血管内皮细胞胞浆内，在肾小球系膜区及肾间质内可见RANTES阳性细胞，肾小管损伤愈严重、间质浸润细胞愈多的部位，表达愈强。正常肾组织中的RANTES表达主要见于肾小管上皮细胞及散在的间质细胞，肾小球内RANTES表达极弱。慢性移植肾失功患者肾组织中RANTES的表达随着炎症细胞浸润及间质纤维化/小管萎缩的程度加重而增多，具有正相关性。
　　 3、统计结果
　　 3.1 统计结果表明CRAD患者移植肾IF/TA病理分级与p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1和α-SMA的表达的关系根据CRAD患者IF/TA病理分级各组肾小管间质中p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1和α-SMA的表达比正常肾组织的表达明显增多，组间均有显著性差异(P值均＜0.001)，E-cadherin的表达比正常肾组织中明显减少，组间均有显著性差异(P＜0.001)。p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1和α-SMA的表达随CRAD病理分级增加呈递增趋势（各组间比较P＜0.001），E-cadherin的表达随IF/TA病理分级增加呈递减趋势（各组间比较P＜0.001）。
　　 CRAD各组肾小管间质表达的p-Akt、GSK-3β与ILK、TGF-β1及α-SMA表达的相关性线性相关性分析显示，肾小管间质表达的p-Akt与ILK、TGF-β1及α-SMA分别呈正相关;GSK-3β与p-Akt、ILK、TGF-β1及α-SMA分别呈正相关。p-Akt与GSK-3β的表达与E-cadherin表达呈负相关。
　　 3.2 CRAD患者移植肾IF/TA病理分级与p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1和α-SMA的表达的关系MCP-1和RANTES在慢性移植肾失功组肾小管、间质的表达比正常肾组织明显增多，两者间差异均有显著性（P值均＜0.001），MCP-1和RANTES随慢性移植肾失功炎症细胞浸润程度和IF/TA病理分级的加重而呈增加的趋势;通过Image-Pro软件分析，慢性移植肾失功患者移植肾组织中MCP-1和RANTES的表达均明显高于正常肾组织，并与炎症细胞浸润和间质纤维化/小管萎缩呈正相关。
　　 结论:
　　 1、慢性移植肾失功移植肾病理组织学改变主要表现为炎症细胞浸润、肾间质纤维化和肾小管萎缩。
　　 2、慢性移植肾失功移植肾肾小管间质中p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1和α-SMA表达增多，且随着IF/TA病理分级的加重呈现增多的趋势，E-cadherin的表达随着IF/TA病理分级的加重呈现减少的趋势。
　　 3、慢性移植肾失功移植肾小管间质中MCP-1和RANTES呈高表达，且随CRAD炎症细胞浸润程度和IF/TA病理分级的加重而呈增加的趋势，提示MCP-1和RANTES可能通过介导炎症细胞浸润参与CRAD纤维化的发病机制。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

一、主要材料

二、研究对象

三、移植肾穿刺活检方法

四、病例图片染色步骤

五、病理图片分析及诊断分级标准

六、免疫组化染色计算机真彩色图像分析系统(imagepro-plus 6．0)半定量分析方法

七、统计学处理

第三章 结果

一、病人的一般情况及移植肾组织分组

二、慢性移植肾失功病理组织学改变主要特点

三、肾小管间质中p-Akt、GSK-3β、ILK、TGF-β1、E-cadherin和α-SMA的表达

四、肾小管间质MCP-1及RANTES表达

第四章 讨论

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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