HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化、鉴定及应用性研究

摘要

研究背景及目的:艾滋病是目前人类面临的最严重的疾病之一。据2011年统计，全球艾滋病毒感染者仍有3400万人，其中新增感染者为250万，另有170万人死于与艾滋病有关的疾病。此外，还有680万感染者无法及时得到医治，所以艾滋病防治形势依然严峻。由于HIV本身的反复突变，对HIV疫苗的研制至今也尚未成功。因此，目前能与之抗争的最有效的手段仍以预防为主，能否对HIV感染做出快速准确的诊断是阻止其流行扩散的关键，因为对每位HIV感染者血清状况的了解有助于防止感染的再次传播。
　　 HIV编码结构蛋白的基因包括Gag、Pol、Env。gag基因产生55kDa蛋白p55。p55由病毒编码的一个蛋白酶切成四个小蛋白:MA(p17基质)、CA(p24衣壳)、NC(p9核衣壳)及p6。p24是HIV病毒颗粒的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中发挥重要作用。p24蛋白的氨基酸序列在HIV各毒株之间高度保守，缺失p24的病毒无法正常组装。HIV感染人体后，感染者血液中首先出现的病毒标志物为病毒p24蛋白。由于从病毒感染到检出抗HIV抗体之间存在较长的窗口期，因此，HIV-1 p24抗原检测在HIV感染的早期诊断、预后判断、抗HIV药物筛选及判断母婴传播等方面具有重要意义。
　　 目前，对HIV感染的检测方法包括抗体检测、p24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等。由于从感染HIV到出现可检测的抗体尚有一段时间，因此虽然抗-HIV抗体检测的ELISA试剂经历了4代发展，但其“窗口期”问题仍不可避免，而可以进一步缩短“窗口期”的核酸检测和CD4+T淋巴细胞水平检测，由于检测过程较复杂、耗时较长且需要特殊仪器而不易普及。
　　 HIV感染机体后的1～2周，血液中首先出现的病毒标志物为核心蛋白p24，病毒感染1～2个月内才能产生特异性抗体，所以仅是检测抗HIV抗体存在较长的检测窗口期。国外已经成功研制了HIV抗原和抗体联合测定的酶免试剂盒并用于HIV感染的检测。p24抗原的测定主要用于HIV感染的早期检测，可缩短感染HIV病毒到检出的窗口期至12～15d，在现有的HIV抗体测试剂中加入p24抗原的检测功能，用于献血员的检测和流行病学调查，可有效地避免窗口期的漏检，减少HIV传播的可能。
　　 HIV侵入机体后，核心抗原p24的水平随着病毒RNA水平的发展而发展，并在急性感染期即可出现，通常被认为是病毒复制的间接标志，与病情发展密切相关。因此，血液及其它体液标本中p24抗原的检测可以缩短窗口期，有助于HIV的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果，具有良好的实际应用价值。
　　 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）是一种灵敏的高端定量免疫检测技术，是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体，因镧系稀土离子具有独特的荧光特性，该技术能够获得极高的信噪比，从而具有很高的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高的临床应用价值。该技术适用于各种抗原抗体的临床检测，在市场上已得到广泛应用。有必要再开发出高灵敏度的HIV抗原的时间分辨荧光免疫分析检测技术，应用于临床检测，完善产品群。
　　 方法:
　　 1.p24表达工程菌的构建及鉴定:利用PCR技术扩增了p24基因，并进行核酸电泳鉴定大小。扩增出的目的基因片段测序并与GenBank中序列进行比对，然后将编码基因克隆到pET-28a(+)原核表达质粒中，经PCR、限制性酶切分析等鉴定后转化B121(DE3)大肠杆菌，构建p24-pET28a(+)/BL21原核表达工程菌。
　　 2.重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定:经IPTG诱导后，HIV-1 p24基因在大肠杆菌E.coli DE3中表达His-tag融合重组蛋白。超声破菌后用亲和层析法纯化重组蛋白，透析、复性得到有活性的目的蛋白。用阳性病人血清对表达产物进行Western-blot分析和间接ELISA分析，鉴定所表达的p24抗原的活性与抗原性。
　　 3.用双抗体夹心法研制人免疫缺陷病毒抗原时间分辨荧光免疫分析试剂
　　 3.1以正常人血清作为阴性对照，以正常人血清稀释p24抗原作为阳性对照。
　　 3.2包被用的HIV p24单抗和标记用的二抗均购自杭州启泰生物技术有限公司，对照用的HIV p24抗原购自深圳菲鹏生物股份有限公司。
　　 3.3 Eu3+标记抗体的制备。
　　 3.4采用棋盘滴定法对最佳包被量及标记抗体最佳稀释度进行确定。
　　 3.5参考值范围:以自制的p24-TRFIA试剂检测80份健康人血清，统计血清p24抗原水平的分布情况，计算样本荧光值与阴性对照的比值。取比值的平均值，以比值均值加两个标准差，初步确定为正常人参考值，再综合其他文献研究资料及临床现行参考值范围，最终确定参考值范围。
　　 3.6性能评价
　　 3.6.1剂量反应曲线和精密性;
　　 3.6.2特异性分析;
　　 3.6.3抗干扰性分析;
　　 3.6.4稳定性;
　　 3.6.5临床血样的测试结果
　　 1.HIV-1 p24-pET28a(+)原核表达载体的构建利用PCR技术成功扩增了p24基因。核苷酸序列测定显示，其大小为693bp，与GenBank中序列进行比对，结果显示该DNA片段的核苷酸序列与已报道的p24基因序列一致，无移码突变。并且成功的将p24基因克隆到pET28a(+)原核表达质粒，经PCR、限制性酶切和测序等鉴定，证实成功构建了p24-pET28a(+)重组原核表达质粒。
　　 2.p24抗原的表达、纯化及鉴定经IPTG诱导重组质粒p24-pET28a(+)在大肠杆菌BL21中表达出p24的融合蛋白，分子量约为26kDa，与理论值基本符合，表达产物主要以包涵体的形式存在。重组蛋白经过包涵体洗涤，Ni亲和层析纯化后，纯度均达80％以上。用HIV阳性血清对表达产物进行Western-blot分析，显示在26kDa处出现特异性反应条带，间接ELISA亦显示，该p24抗原与阳性血清发生特异性反应。表明该重组蛋白具有较好的免疫反应性。
　　 3.双抗体夹心法研制人免疫缺陷病毒抗原时间分辨荧光免疫分析试剂
　　 3.1.综合考虑本底信号值、信噪比等因素，选择2μg/mL作为最佳包被抗体浓度，1∶200作为标记抗体的最佳稀释度。
　　 3.2.参考值范围:80份查体者血清，检测荧光值与阴性对照比值平均值(X)为1.3422，标准差(SD)为0.67，均值加2个标准差等于2.68，而当检测荧光值与阴性对照比值在2.1以下时，包含了99.0％的样本。据此设定本方法检测时的阳性判定标准为:cutoff值=阴性对照荧光值×2.1。
　　 3.3.性能评价的结果显示
　　 3.3.1HIV p24抗原时间分辨荧光免疫分析法在检测时不受甘油三酯（体积比5％）、胆红素(0.32mg/mL)、血红蛋白(180mg/mL)的干扰，无假阳性、假阴性出现，特异性符合临床诊断的要求。
　　 3.3.2自制反应模式检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体抗体的阳性样本，结果均为HIV抗原阴性，说明自制反应体系检测血样时不受这些因素的干扰。
　　 3.3.3该反应体系放置于37℃7天，各项性能指标均符合要求，稳定性较好。
　　 3.3.4该方法测试的24份抗体阳性的血清中有6份p24抗原阳性结论以上结果表明，本研究成功地构建了p24-pET28a(+)原核重组表达系统，并在大肠杆菌BL21中大量表达与目标蛋白的大小一致融合蛋白，分子量约26kDa。经过Wester Blot和间接ELISA鉴定表明，本实验表达的p24抗原能被HIV阳性病人血清特异性识别。因此，本研究表达的p24抗原具有较强免疫活性。
　　 HIV p24抗原的双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法的各项指标（灵敏度、精密性、特异性、稳定性等）均能够满足临床检测试剂要求，临床考核合格，但是受HIV的血样收集的限制，血样不是很多，待收集到更多的血样，在本方法中进行检测，并与国家食品与药品监督管理局认可的检测p24抗原的试剂进行检测对比，通过进一步实验，有望制备出可以替代相应能够检测p24抗原的ELISA试剂盒。
　　 在检测抗体的实验中用本实验自制的p24作为抗原检测HIV阳性病人血清中的抗体，接下来在p24抗原时间分辨荧光免疫分析法的研究中，可见自制的p24抗原和市售的p24抗原有相似的抗原性，就把自制的p24抗原做为抗原标准品应用到下面的时间分辨荧光免疫分析法的实验中。

目录

摘要

前言

第一章 p24表达载体的构建及鉴定

1．1 材料

1．1．1 引物

1．1．2 质粒与菌株

1．1．3 主要试剂

1．1．4 主要仪器

1．1．5 主要溶液的配制

1．2 方法

1．2．1 引物设计

1．2．2 PCR反应模板—gag基因的制备

1．2．3 PCR反应体系

1．2．4 重组质粒p24-pET28a(+)的构建与鉴定

1．2．5 感受态细胞的制备

1．2．6 转化

1．2．7 重组质粒的鉴定

1．3 结果

1．3．1 PCR

1．3．2 p24-pET28a(+)重组表达质粒的筛选及鉴定

1．3．3 测序鉴定

1．4 讨论

1．5 本章小结

第二章 重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 人血清样本

2．1．3 主要仪器

2．1．4 溶液及培养基配制

2．2 方法

2．2．1 重组蛋白的诱导表达及产物的SDS-PAGE分析

2．2．2 重组质粒在大肠杆菌中的大量诱导表达

2．2．3 包涵体的洗涤

2．2．4 表达产物的纯化及复性

2．2．5 表达产物的Western-blot鉴定

2．2．6 表达产物的间接ELISA法鉴定

2．3 结果

2．3．1 重组质粒p24-pET28a(+)的表达

2．3．2 p24的大量表达及包涵体的洗涤

2．3．3 重组蛋白的纯化及复性

2．3．4 重组p24抗原的Western blot鉴定

2．3．5 重组p24抗原免疫反应性测定

2．4 讨论

2．5 本章小结

第三章 HIV-1 p24抗原时间分辨荧光免疫分析方法的研究

3．1 材料

3．1．1 主要材料

3．1．2 标本

3．1．3 主要溶液

3．1．4 主要实验仪器

3．2 方法

3．2．1 反应模式的选择

3．2．2 阴、阳性对照的制备

3．2．3 包被

3．2．4 Eu3+标记抗体的制备

3．2．5 操作流程

3．2．6 方法学评价

3．3 结果

3．3．1 标记抗体的浓度和蛋白回收率

3．3．2 最佳包被量及标记抗体最佳稀释度的选择

3．3．3 参考值的确定

3．3．4 剂量-反应曲线

3．3．5 自制的p24抗原与市售的p24抗原比较

3．3．6 特异性分析

3．3．7 精密度试验

3．3．8 抗干扰性分析

3．3．9 稳定性试验

3．3．10 临床血样检测试验

3．4 讨论

3．5 本章小结

参考文献

英文缩写词

硕士期间科研成果

致谢

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