柴胡皂苷a的抗惊厥及镇静催眠作用的实验研究

摘要

背景:
　　 癫痫是一组由多种病因所引起，脑部神经元高度同步化，且常具自限性的突发性异常放电所致，以发作性、短暂性、重复性和通常为刻板性的中枢神经系统功能失常为临床特征的综合征。长期反复的痫性发作给病人身体、心灵带来巨大的创伤，造成癫痫病人的自杀率高出正常人群3-5倍，同时由于癫痫发作不分场合、时间，故时刻需要家属陪同，无疑给家庭造成不小的负担。因此，癫痫不仅是一个医学问题，而且已经成为当今一个严重的社会问题。
　　 据WHO1997年统计报告显示，癫痫在发达国家、经济转轨国家、发展中国家和不发达国家的患病率分别为5.0％、6.1％、7.2％、11.2％，估计全球共有约5000万癫痫患者。我国癫痫的发病率约29/10万/年，年新增发患者数为35万人，而患病率为3.6％-7％，现有癫痫患者900多万人。癫痫死亡率为2.42/10～7.82/10万，但真正因癫痫死亡（死于癫痫持续状态）的只占所有死因的20％，有40.21％患者因意外事件死亡，死于自杀者5.51％，不明原因死亡占4.13％。
　　 癫痫的控制目前仍以化学药物为主，约70％的病人通过药物的治疗可以获得完全缓解，但抗癫痫药物长期服用安全性差，约33.5％的癫痫患者会由抗癫痫药物产生各种毒副作用;约25.3％的成人患者及13.4％的儿童癫痫患者对药物产生抵抗，成为顽固性癫痫。外科手术常应用于一些难治性癫痫的治疗，但由于风险大，费用昂贵，而且术后仍有复发风险等原因，因此癫痫的治疗仍以药物为主，这就需要探索出安全的新型抗癫痫药物。数千年的中医临床实践证明:中药治疗癫痫具有毒副作用低的特点，这为抗癫痫新药的开发带来新机遇。
　　 癫痫属于中医“痫病”范畴，病机与肝的疏泄失常密切相关。临床研究表明，癫痫“从肝论治”并运用自拟方柴胡疏肝汤治疗癫痫，取得了满意的疗效;本课题组早期实验研究发现癫痫“从肝论治”的复方柴胡疏肝汤能明显抑制戊四氮致痫大鼠的痫性发作，并能减轻难治性癫痫大鼠的癫痫发作级别且抑制多药耐药蛋白(P-GP)的表达。自拟方中柴胡用量最大，是方中的君药，柴胡性辛、苦，微寒，属辛凉解表药，归肝胆经，有解表退热、疏肝解郁、升阳举陷、截疟之功。本课题组前期研究表明，柴胡及柴胡总皂苷具有镇静和抗癫痫作用，能够降低MES及PTZ诱导的小鼠惊厥率，柴胡皂苷a(SSa)为柴胡总皂苷的主要成分之一，已经证实的药理作用有降血脂、抗渗出、抗肉芽肿、保护肝细胞、免疫调节和抗菌等，课题组前期研究表明，SSa能够抑制谷氨酸诱导的星形胶质细胞钙离子升高和IL-6的释放，抑制PTZ诱导星形胶质细胞TNF-α释放及TNFR1的高表达，通过建立匹罗卡品致难治性癫痫大鼠的慢性模型，发现SSa有减少难治性癫痫模型大鼠的痫性发作次数、平均发作时间及发作级别、影响大鼠的脑电图活动和下调海马区P-GP的表达的作用，但SSa是否具有良好的抗惊厥作用报道甚少。
　　 借助于实验动物模型筛选抗癫痫药物，是神经科研究的主要手段。为了进一步评价SSa的抗惊厥作用，本课题选用筛选抗惊厥药物的常用动物急性癫痫模型:①最大电惊厥模型:该模型被认为是目前筛选抗强直-阵挛性发作药物的最有效的动物模型;②戊四氮模型:戊四氮是GABA受体拮抗剂，一般认为能明显对抗戊四氮所致惊厥的药物，临床上对失神发作常有效;③士的宁模型:士的宁为中枢神经系统内抑制性递质甘氨酸的拮抗剂，该模型被认为是难治性癫痫的良好模型;④匹鲁卡品模型:匹罗卡品是胆碱能毒蕈碱受体激动剂，通过系统给药可以诱发癫痫的持续状态，现在常用来做难治性癫痫的研究模型。本实验观察SSa对四种急性癫痫模型的干预作用，从多角度系统评估SSa的抗惊厥作用，并选用自发活动实验及阈剂量戊巴比妥钠诱导睡眠实验方法，评估SSa的镇静催眠作用，为癫痫的临床治疗提供实验依据。
　　 目的:
　　 本研究拟建立小鼠最大电惊厥(MES)模型、戊四氮模型、士的宁模型及匹鲁卡品模型四种急性癫痫模型，多角度、系统地评价SSa的抗惊厥效果，通过自发活动实验及戊巴比妥钠阈剂量诱导睡眠实验来评价SSa的镇静催眠作用，并试图推测SSa的可能的抗惊厥机制，为癫痫的临床治疗提供实验依据。
　　 方法:
　　 1.对小鼠最大电惊厥(MES)模型的作用
　　 实验前一天筛选合格的小鼠50只随机分为5组，分别为对照组、地西泮组(4mg/kg)、柴胡皂苷a的高剂量(4.36mg/kg)、中剂量(2.18mg/kg)、低剂量(1.09mg/kg)组，对照组腹腔注射等容积的5％吐温-80溶液，60min后进行电刺激。按文献方法使用YSD-4G药理生理实验多用仪对小鼠进行MES实验，刺激参数为100V，2Hz，单次刺激方式，以后肢强直性伸直为惊厥指标，记录惊厥数、后肢强直持续时间，计算惊厥率及死亡率。
　　 2.对小鼠戊四氮致痫模型的作用
　　 实验分组及给药方式同最大电惊厥模型，于给药60min后，腹腔注射戊四氮85mg/kg，连续观察30min，记录小鼠惊厥潜伏期，包括从给药到出现Ⅰ-Ⅲ级惊厥发作的时间（阵挛潜伏期）及从给药到出现强直性惊厥的时间（强直潜伏期），记录并计算30min内小鼠死亡率。
　　 3.对小鼠士的宁致痫模型的作用
　　 实验分组及给药方式同最大电惊厥模型，于给药60min后，腹腔注射士的宁2.5mg/kg，连续观察15min，记录从给药到出现Ⅰ-Ⅲ级惊厥发作的时间（阵挛潜伏期）及从给药到死亡的时间（死亡潜伏期），及计算15min内小鼠死亡率。
　　 4.对小鼠匹鲁卡品致痫模型的影响
　　 实验分组及给药方式同最大电惊厥模型，于给药60min后，腹腔注射匹鲁卡品400mg/kg，连续观察15min，记录从给药到出现Ⅰ-Ⅲ级惊厥发作的时间（阵挛潜伏期）及从给药到死亡的时间（死亡潜伏期），及15min内小鼠死亡率。
　　 5.对小鼠自发活动的影响
　　 实验分组及给药方式同最大电惊厥模型，给药前把小鼠投入动物活动箱中适应5 min后开始给药，记录给药时间，给药60 min后，记录前2min内的小鼠走动时间和双前肢向上抬举次数。
　　 6.对小鼠阈剂量戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响
　　 实验分组及给药方式同最大电惊厥模型。给药60min后，各组小鼠分别腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg。观察动物给药后有无出现活动减少、安静、嗜睡或睡眠等表现，入睡以翻正反射消失为指标，观察并记录入睡潜伏期（末次给药至翻正反射消失时间）和睡眠持续时间（翻正反射消失至恢复的时间）。
　　 7.统计学方法
　　 数据用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（(x)±s）表示，多样本均数的比较采用One-Way ANOVA方差分析，组间多重比较若符合方差齐性检验时用Tukey法，若不符合则用Dunnett' T3法，计数资料及率的比较用卡方检验。以P＜0.05均为有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.SSa对最大电惊厥模型的影响
　　 与对照组相比，不同剂量的SSa均能不同程度得抑制MES所致小鼠后肢强直性伸直的发生，其中SSa高剂量组与对照组相比有统计学差异(P＜0.05)，但后肢强直性伸直的持续时间组间差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 2.SSa对戊四氮致痫模型的影响
　　 与对照组相比，SSa中、高剂量组与地西泮组均能明显延长戊四氮所致小鼠阵挛潜伏期及强直潜伏期（P＜0.01），SSa高剂量组可以减少小鼠30min内死亡率（P＜0.05）。
　　 3.SSa对士的宁诱发惊厥模型的影响
　　 与对照组相比，除地西泮，SSa各剂量组均不能延长士的宁所致小鼠的阵挛潜伏期及死亡潜伏期，亦不能降低小鼠15min内死亡率（P＞0.05）。
　　 4.SSa对匹鲁卡品诱发惊厥模型的影响
　　 与对照组相比，SSa高剂量组及地西泮组均能延长匹鲁卡品所致小鼠的阵挛潜伏期及死亡潜伏期(P＜0.01);除地西泮组，各剂量组均不能降低小鼠15min内死亡率。
　　 5.SSa对小鼠自发活动的影响
　　 与对照组比较， SSa高、中剂量组及地西泮组对小鼠走动时间均有明显减少（P＜0.01）。而与对照组比较，SSa高、中剂量组及地西泮组小鼠前肢上抬次数有明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。与对照组比较，SSa低剂量组可以减少走动时间及双前肢上抬次数，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 6.SSa对对小鼠阈剂量戊巴比妥钠睡眠时间的影响
　　 与对照组对比，SSa高、中剂量组及地西泮组对小鼠入睡潜伏时间均有明显降低（P＜0.01）。而与对照组对比，SSa高、中剂量组及地西泮组对小鼠入睡持续时间均有明显的增加（P＜0.01）。与对照组相比，SSa低剂量组可以降低小鼠入睡潜伏时间及增加睡眠持续时间，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 结论:
　　 1.本研究成功建立最大电惊厥、戊四氮、士的宁及匹罗卡品诱发急性癫痫模型，上述模型技术成熟，操作相对简单，成功率较高，并且有一定的代表性。
　　 2.SSa能不同程度得降低MES所致小鼠后肢强直性伸直的发生率，以高剂量组效果明显;SSa能明显延长戊四氮所致小鼠阵挛潜伏期及强直潜伏期，并呈一定的剂量依赖性，其中SSa中、高剂量组效果明显;SSa高剂量组可以明显延长匹罗卡品所致小鼠的阵挛潜伏期及死亡潜伏期。
　　 3.SSa有明显的镇静催眠作用，可以减少小鼠走动时间及双前肢上抬次数，降低小鼠入睡潜伏时间及增加睡眠持续时间，其效果呈一定的剂量依赖性，以中、高剂量组效果明显。
　　 4.SSa对最大电惊厥模型、戊四氮模型及匹罗卡品模型有效，提示其临床上可能对癫痫强直-阵挛性发作、失神发作及部分难治性癫痫有效。

目录

摘要

前言

第一章 SSa抗惊厥作用的实验研究

实验一：SSa对最大电惊厥模型的影响

1 材料和方法

实验二、SSa对戊四氮致病模型的影响

1 材料和方法

实验三、SSa对士的宁致痫模型的影响

1 材料和方法

实验四、SSa对匹鲁卡品致病模型的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 SSa镇静催眠作用的实验研究

实验一、SSa对小鼠自发活动实验的影响

1 材料和方法

实验二、SSa对阈剂量戊巴比妥钠诱导睡眠实验的影响

1 材料和方法

2、结果

3、讨论

参考文献

全文小结

缩略词表

在读期间发表论文情况

致谢

声明