氧化应激晶状体上皮细胞中黏着斑激酶的表达

摘要

背景：
　　 晶状体上皮细胞((l)ens epithelial cells，LECs)是位于晶状体前囊膜下的一层单层立方上皮细胞，其代谢活跃，具有生长、分化和创伤刺激后发生愈合反应的能力。晶状体上皮细胞起到对晶状体的营养、代谢、损伤修复作用，是维持晶状体透明性的最重要的防线，任何原因（如衰老、营养代谢异常、中毒变性、外伤等）破坏LECs的正常结构和功能，都可能导致不同类型的晶状体混浊。在既往的研究中，人们通过对比正常人与白内障患者的LECs，发现白内障患者LECs有三个特点:形态改变、密度下降、局部增殖导致细胞复层排列或向后囊移行。这些形态结构的异常，是晶状体发生浑浊的机制之一。因此，研究晶状体上皮细胞的形态、结构、凋亡等生物学特性是研究晶状体疾病的重要基础。
　　 白内障的发生发展与晶状体长期处于氧化应激状态有密切的联系。通常认为，过量的氧化应激是外界各种致白内障因素作用的共同途径，它激活一系列的细胞内信号通路，最终因损伤LECs而导致晶状体的浑浊。在众多导致细胞氧化应激的物质中，过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)是最重要的物质。正常人的晶状体及房水中存在一定数量的自由基，其中H2O2的浓度约为20-30μmol/L，而在白内障患者的房水中可高达660μmol/L，为正常患者的30倍。由于氧化应激，LECs膜通透性改变，细胞内的蛋白质漏出，房水成分发生改变，细胞内环境改变，稳定性下降;细胞内蛋白质结构发生改变，细胞生理功能、透明度受到影响;DNA受损，晶状体上皮细胞凋亡，进而无法供给晶状体代谢所需的营养物质，加重氧化应激的损害。这一系列的变化都能导致晶体的浑浊。氧化应激激起了白内障发生、发展过程中恶性循环。可见，H2O2诱导LECs的氧化损伤是白内障发生发展的起始途径，研究晶状体上皮细胞的氧化应激机制是研究年龄相关性白内障发生发展机制的重要方面之一。
　　 黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）是一种位于细胞质的非受体型酪氨酸激酶。FAK自发现起至今已近20年，目前认为FAK在诱导细胞增殖、细胞粘附、迁移、抗凋亡、纤维化、分化方面都起到了一定的作用。(1)在细胞增殖方面，细胞与ECM的连接是细胞增殖的必要条件。整合素与细胞外基质连接后，在生长因子的刺激下，FAK被激活，通过MAPK或PI3K的激活促进细胞增殖。(2)在细胞粘附移行方面，已有大量研究证实FAK与细胞的移行有重要的关系，而且细胞的移行依赖于细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)-整合素-FAK这一系列因素的相互作用。(3)在抑制凋亡方面，FAK家族对细胞有不同的影响。抑制FAK能导致细胞的凋亡，这可能与PI3-K/Akt-1和MEK/Erk信号通路相关。总而言之，由于FAK位于多条信号通路的上游，其对细胞生物行为的各个方面都起到一定的调节作用。
　　 目的：
　　 通过过氧化氢处理晶状体上皮细胞，制造氧化应激模型，研究氧化应激晶状体上皮细胞的增殖、移行、凋亡、及形态学的改变，同时，观察细胞内黏着斑激酶的动态表达及活化程度，初步探讨黏着斑激酶是否对氧化应激晶状体上皮细胞的调控功能。
　　 方法:
　　 1、晶状体上皮细胞培养与处理:人品状体上皮细胞(HLECs)细胞株，购自美国ATCC。细胞用含有10％FBS的低糖DMEM培养基培养，于37℃、体积分数5％的CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。细胞达到80％-90％融合后，用不含血清、H2O2含量分别为0，30，50，70，100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM细胞0，30min，3h，6h，12h，24h。
　　 2、CCK-8法检测细胞存活率:将细胞密度调至1×108/L，并将细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μL，置37℃，体积分数5％CO2培养箱中孵育，24h细胞贴壁后弃上清，对照组（H2O2浓度为0μmol/L）加100μL低糖DMEM培养液，处理组分别加入H2O2浓度为30，50，70，100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM100μL，每组设六个复孔，继续孵育30min，3h，6h，12h，24h。避光取出，弃上清，PBS洗涤两次，每孔加入100μL培养基和10μL CCK-8，再加入一组空白对照组（为无细胞组，仅加入培养基与CCK-8）至于培养箱内2h，全自动酶标仪进行比色，波长为450nm，测每孔吸光度A值。计算药物对细胞的生存率。生存率(％)=（实验组A值-空白组A值）/(对照组A值-空白组A值)×100％。
　　 3、细胞划痕实验检验细胞移行能力:将进入对数生长期的检测细胞用100μL无菌枪头在每个孔中长满的单层细胞上迅速而轻轻地划1～2道痕，弃培养基，PBS冲洗3遍以去除掉脱落的细胞及培养基中的细胞因子。对照组加入不含H2O2的培养基，处理组分别加入H2O2浓度为100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM，每组设4个复孔，测量8个值，分别于0时，12h，24h拍照观察，通过图像处理系统测量细胞爬行的距离，比较不同细胞划痕修复速度。
　　 4、流式细胞仪检测细胞凋亡情况:取对数生长期HLECs，接种于6孔板，长至90％融合后弃上清，移液管吸净培养液，无菌PBS液洗细胞3次。对照组加入不含H2O2的培养基，处理组分别加入H2O2浓度为100μmol/L、1000mol/L的低糖DMEM处理24h。按照美国eBioscience公司Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒步骤进行细胞凋亡流式细胞仪检测。
　　 5、激光共聚焦显微镜观察细胞内黏着斑激酶的表达与分布:细胞爬片后，对照组加入1000μL低糖DMEM培养液，处理组分别加入H2O2浓度为100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM1000μL置37℃，体积分数5％CO2培养箱中孵育24h。弃去上清，PBS清洗三次，4％多聚甲醛室温固定5min，PBS清洗三次，-80℃甲醇-20℃固定15min，PBS清洗三次。山羊血清封闭1h，PBS清洗后加入1∶200兔抗人FAK一抗4℃湿盒中孵育过夜。PBS清洗3次后，Hoechst33258染核1小时，FITC荧光二抗孵育30min后，PBS清洗多余二抗，甘油封片。避光保存，激光共聚焦显微镜下观察。
　　 6、western blot检测细胞内FAK和磷酸化FAK的动态表达:细胞接种于6孔板上，长至90％融合，弃上清。PBS清洗后，对照组加1000μL低糖DMEM培养液，处理组（实验组）分别加入H2O2浓度为100，300，500，700，1000μmol/L的低糖DMEM1000μL，二氧化碳培养箱内培养30min，3h，6h，12h，24h。分别收集细胞，提取蛋白质，取15μl蛋白上样于8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳;转移样品蛋白于PVDF膜上;3％BSA室温封闭1h，1∶1000FAK一抗4℃孵育过夜;TBST洗膜3次，加1∶5000的辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h; TBST洗膜3次后，浸入增强化学发光试剂，暗室X线片压片曝光，洗片。图片经光密度图像扫描仪扫描，Flour Chem程序测定条带光密度值。
　　 7统计处理采用SPSS13.0软件对实验数据进行统计分析。变量采用（(x)±s）描述。通过One-way ANOVA法分析比较CCK-8各个时间点中不同浓度组间的细胞存活率的差异，比较细胞划痕实验中不同浓度组中细胞的移行速度的差异，比较流式细胞结果中不同浓度处理组间细胞凋亡、死亡、存活率的差异，比较western blot实验中不同浓度组间FAK表达量的差异，LSD法（方差齐）或Dunnelt's T3法（方差不齐）对组间进行两两比较。采用Two-way ANOVA分析不同浓度过氧化氢和不同处理时间对细胞移行速度是否存在交互效应。P＜0.05表示有统计学意义。
　　 结果：
　　 1、高浓度过氧化氢处理晶状体细胞24h后，细胞形态发生改变:贴壁细胞变得稀疏，细胞皱缩、轮廓增强、边缘僵硬，并由原来的多边形变成细长型，形成伪足，细胞核与细胞浆界限不明显。而FAK分布也集中至细胞拉长部位。
　　 2、处理12小时以内，500μmol/L浓度以上的过氧化氢对细胞有杀伤作用;处理24h时，不同浓度处理组间细胞存活率差异有统计学意义F=17.96，p＜0.01。30，70，100，300μmol/L组的细胞较对照组增殖明显，其存活率分别达到1.24±0.03％(p＜0.01)，1.35±0.08％(p＜0.01)，1.75±0.19％(p＜0.01)与1.37±0.17％(p=0.04)，但100μmol/L组与50，70，300μmol/L之间没有明显差异(p50=0.20，P70=0.051，p300=0.10)。而500，700，1000μmol/L组细胞存活率较之对照组降低(p500＜0.01,P700＜0.01,p1000＜0.010)。
　　 3、在无血清情况下培养细胞24h，100μmol/L组细胞移行速度最快，达到62.23±1.99单位/小时(p＜0.01)，对前、后12个小时移行速度进行两组间比较(two-way ANOVA)发现，细胞移行速度除受到H2O2浓度影响外(F=23.34，p＜0.01)，还受到时间因素的影响(F=27.76，p＜0.01)。此外，时间与浓度之间还存在交互效应(F=9.61，p＜0.01)。
　　 4、细胞凋亡率总体差异有统计学意义(F=7.49，p=0.02)。对组间进行两两比较发现，100μmol/L浓度处理组细胞总体凋亡率为2.40±0.01％，低于对照组的5.04±0.00％(p=0.01)及1000μmol/L浓度组的4.61±0.01％(p=0.02)比。而1000μmol/L浓度组细胞的凋亡程度与对照组比差异无统计学意义。
　　 5、0，100，300，500，700及1000μmol/L的H2O2处理细胞24h后，细胞中FAK含量发生改变。其中，100，300μmol/L浓度组处理24小时后，FAK表达量增加，而700，1000浓度处理过后FAK表达量降低，差异有统计学意义(p＜0.05)。在此过程中，FAK磷酸化被激活，随处理浓度和处理时间的改变而改变。
　　 结论：
　　 过氧化氢对晶状体上皮细胞有着双重影响:100μmol/L的H2O2能提高细胞内FAK的表达，促进细胞增殖、移行，抑制细胞的凋亡。而1000μmol/L的过氧化氢抑制细胞内FAK的表达，对细胞生理功能产生抑制作用，并能导致细胞死亡。

目录

摘要

前言

第一章 过氧化氢对HLECs形态、增殖、移行、凋亡的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二章 过氧化氢处理晶状体上皮细胞中黏着斑激酶的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

全文结论

本研究不足之处

参考文献

缩写词简表

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