地西他滨联合高三尖杉酯碱对Skm--1细胞株凋亡和表观遗传学修饰作用的初步研究

摘要

目前骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)发病机制尚未明确，疾病的发展涉及多种因素。近年来对MDS的研究发现表观遗传学的改变在MDS的形成中起了重要的作用。表观遗传学(epigenetics)是指基因序列不发生变化，但基因表达水平变化，包括DNA异常甲基化、组蛋白异常乙酰化以及非编码RNA的改变等形式，其中以前二种所起作用比较重要。DNA甲基化是指在相关酶的催化下，将具有活性的甲基基团转移至胞嘧啶的第五个碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，DNA甲基化在多种重要程序如基因失活、基因印记、转录调节等中具有重要意义。正常情况下基因组(genome)的甲基化模式为:管家基因(house gene)维持无甲基化状态，具有组织特异性的基因在表达该基因的组织中呈现去甲基化状态，而在该基因不表达的组织中则呈甲基化状态。高度甲基化状态下的基因启动子CpG岛阻断基因转录水平，可能机制一为直接抑制转录因子与识别位点结合，其次可能因DNMT1和HDAC及其他DNMT1相关蛋白质结合而成的产物间接抑制与转录因子之间的结合，此种变化是多数抑癌基因沉默的主要原因，也随之引起肿瘤的发生。 去甲基化药物在MDS的治疗中取得一定的疗效。尽管5-AZA和DAC同为核苷类似物，并可作用于DNMTs，但作用机制不尽相同。对于DAC而言，通常认为在高浓度时可抑制DNA合成、诱导细胞死亡，发挥细胞毒作用;而低浓度的DAC则发挥胞嘧啶替代作用与DNMTs共价结合，使DNMTs失活但不会导致细胞死亡，发挥其抗肿瘤功效。 高三尖杉酯碱(HHT)是从我国特色药，目前临床上主要用于治疗急慢性髓系白血病以及MDS。由于HHT具有相对低的髓外毒性以及无蒽环样心脏毒性，因而适合于老年患者。作为植物提取药，HHT具有此类药物共有的特点，即比较广泛的作用范围以及非常复杂的作用机制等。HHT显示出广泛的抗肿瘤作用。体外实验显示HHT对各肿瘤细胞株HL-60、U937、Thp-1、HEL和K562均可诱导凋亡。HHT诱导HL-60细胞发生凋亡，且通过基因敲除技术证实该凋亡的发生与Bax无关;HHT介导的凋亡中可降低线粒体膜电位以及释放细胞色素C，且不伴细胞内活性氧的蓄积。对于Caspase系列酶活力检测发现HHT并不引起caspase-8的活化，也不促发Bid的裂解，却可通过活化caspase-9从而活化caspase-3。对多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)的研究表明HHT通过活化caspase-3，8，9诱导细胞凋亡，该作用与PI3K/Akt磷酸化抑制相关，并能够下调XIAP，cIAP和cyclinD1等基因表达。在对慢粒细胞株K562细胞的研究显示，HHT可下调BCR/ABL、ABL和c-Myc的蛋白水平以及p-STATS的磷酸化，提示HHT对K562的凋亡诱导作用可能是由于降低BCR/ABL，抑制JAK-STATS通路相关。然而在另外一项同样采用K562细胞的研究中发现HHT的致凋亡作用是与激活TGF-β和TNF介导信号通路相关。 尽管近来临床上去甲基化药物在MDS患者中的应用，收到了较过去支持治疗或者常规化疗好的疗效，但以去甲基化单药治疗为主的临床疗效仍存在不足。目前的临床试验结果提示单纯的去甲基化药物治疗不能使所有患者受益。DAC临床试验数据显示其疗效虽然较传统支持治疗有优越性，但其CR率低，持续缓解时间短，且不能延长患者的总生存时间，具有死亡率高，不良事件多，耐受性差等特点。因而临床治疗从单药治疗转向联合治疗，且临床试验显示以地西他滨为基础的联合治疗方案一定程度上提高了临床疗效。DAC联合治疗临床试验方案大量出现，目前文献报道的联合方式有DAC+VPA(sodium valproate，丙戊酸钠)、DAC+GO（吉妥单抗）、DAC+克拉法滨(clafarabine)、DAC+维甲酸、DAC+砷剂+维甲酸、DAC+伏立诺他(vorinostat)、DAC+LBH589、DAC+Lenalidomide、DAC+融合蛋白CDX-1401等，虽然截止到目前较多的试验结果尚未公布，但初步的结果已显示出可喜的疗效。 在与DNMT抑制剂联合药物中，HDAC抑制剂(HDACIs)是目前研究得最为深入的。抑癌基因启动子的甲基化和组蛋白去乙酰化导致的基因沉默，是AML和MDS等恶性血液病的分子机制之一，这为DNMT抑制剂和HDAC抑制剂的联合使用提供了理论依据。一系列研究已经证实，HDAC抑制剂单药作用并不能引起去甲基化，但与DNMT抑制剂同时使用或者序贯DNMT抑制剂使用可以在许多肿瘤中协同促进高度甲基化的基因重新表达。 在联合化疗的临床试验研究方面，在DAC与HDACIs类药物VPA联合应用的Ⅰ期与Ⅱ期临床试验中，纳入54名较高危MDS患者及进展期AML患者，在其中10名高危MDS患者中，CR率较高(40％)。而在DAC与GO（吉妥单抗）联合治疗高危-MDS及AML的Ⅱ期临床试验中，总反应率较高(42％)，不良反应少。 在体外研究中，将DAC与HDACIs联合可在细胞凋亡方面发生协同作用，使因表观遗传学修饰后沉默的基因重新表达，进一步研究表明二者具有协同激活促凋亡基因BIK表达的作用[39]。BIK基因属于BCL2家族成员，并且含BH3结构域，能够与多种抗凋亡基因结合，具有抗凋亡作用。在MDS细胞株Skm-1中，使用DAC与HDACI类药物曲古抑菌素A(TSA)研究二者对Skm-1的影响及作用机制，结果显示DAC与TSA均对Skm-1细胞生长有抑制作用，能促进Skm-1细胞分化，凋亡增加，使细胞Fas和P15mRNA表达增加，survivin mRNA表达减少;二者联用后，增殖抑制的协同作用明显增强，Fas mRNA和P15INK4BmRNA表达与单药组相比明显增加，而survivin mRNA表达比单药组更下降，即二者具有协同作用。 基因组甲基化水平检测方法包括高效液相色谱法(high-performance liquidchromatography)、薄层色谱法（thin-layer chromatography）、液相色谱/质谱法(liquid chromatography/mass spectroscopy)以及亲水作用色谱法(hydrophilicinteraction liquid chromatographic，HILIC)等。本实验采用的是基因组甲基化测量的一种替代方法。该方法由M.D.Anderson肿瘤研究中心首先报道。原理如下:基于双磷酸盐(bisulfite treatment)处理DNA后以及同步采用PCR测量多DNA重复序列组元(如Alu和长交错核苷序列LINE)。该PCR产物代表约15000个基因局灶，可以用于直接测序，选择限制性消化或者是荧光测序，以用于计算DNA甲基化。通过限制性消化或者是荧光定量进行验证该分析结果的可重复性好，标准偏离度只有2％。运用此技术发现几乎Alu中2/3的CpG岛呈突变状态，但余下的甲基化区域中87％呈甲基化状态。由于重复序列中甲基化比例较重，该分析在用于检测DNA甲基化程度下降方面十分有效，且该分析经过了甲基化抑制剂DAC在细胞株中的验证，即可发现DAC处理3天后，1-16％的Alu序列以及18-60％的LINE甲基化序列下降。该项技术可以用于基因组甲基化水平检测，并且具有较已有报道的全基因甲基化检测技术工作量小以及对于DNA标本量的需求小等特点。此方法目前已被多组研究采用。 目的:地西他滨作为甲基化酶抑制剂对于治疗MDS有一定疗效，并于2006年被美国FDA批准用于MDS的治疗。地西他滨的单药方案治疗所取得的缓解率(CR)有限，而临床试验中基于地西他滨的联合方案则较单药CR率改善。高三尖杉酯碱(HHT)是一种具有抗肿瘤疗效的生物碱。本文即对地西他滨联合高三尖杉酯碱是否能取得凋亡和甲基化沉默基因的再表达方面的协同作用进行实验研究。 方法:选取四种白血病细胞株进行研究。在二者对于细胞凋亡的协同作用方面，采用克隆形成试验(Colonies formation assay)、细胞活力检测(Cell viabilitytest，MTS)以及流式细胞仪技术AnexinⅤ/PI双染进行检测。在实验分组方面，采用细胞活力检测方法得到的地西他滨和高三尖杉酯碱联合作用时可发挥协同作用的药物浓度比，在该浓度比的基础上进行后续部分实验分组方案的设计。细胞活力检测结果发现Skm-1中当药物浓度比在1∶1时可发挥较好的协同效用，故采用地西他滨（IC50为2.398μmol/L，置信区间1.185～4.560）和高三尖杉酯碱浓度（IC50为39.037nmol/L，置信区间26.305～58.605）分组为DAC0.4μmol/L、DAC4μmol/L、HHT5nmol/L、HHT50nmol/、DAC0.4μmol/L+ HHT5nmol/L、DAC4μmol/L+ HHT50nmol/L进行逆转录PCR以及MSP等检测，并设置细胞株中加入不含药物的同等体积培养基作为对照组。进一步采用实时定量PCR技术来检测凋亡方面(Caspase-3，Caspase-9，Bcl2，Bcl-xl)和去甲基化方面起作用的基因(DNMT1，DNMT3A，DNMT3B)，并采用western blot技术进一步确认以上基因在蛋白水平上的变化。为了说明地西他滨和高三尖杉酯碱在去甲基化方面的作用，采用MSP技术检测LINE-1和ALU的甲基化水平，作为基因组甲基化水平的替代检测指标。另外，为了解XAF1基因在MDS细胞株Skm-1中的甲基化状态，以及本文所研究的药物联合对其甲基化影响，分别采用MSP和定量PCR对XAF1甲基化和mRNA水平进行检测。 结果: HHT和DAC凋亡作用实验（包括细胞活力检测，甲基纤维素克隆形成实验以及流式细胞技术）证实HHT和DAC均有引起细胞凋亡的作用，并呈剂量依赖性。细胞活力检测发现Skm-1、Jurkat、Thp-1、Kg-1a分别在DAC∶HHT比例为1∶1、1∶2、1∶2、1∶1时呈协同作用(CI＜0.8)。 对凋亡相关基因Caspase-3，Bcl2, Bcl-xl(表8，Table8)，分析发现，在单药组，DAC可引起Caspase-3表达增加、Bcl-xl的mRNA表达下降(P＜0.05)，呈现一定的剂量依赖性，而对Bcl2 mRNA水平影响无明显规律;HHT可引起Bcl-xl表达降低（0.341±0.228），而对Bcl2影响不明显。两药联合组中，Skm-1细胞株中Caspase-3 mRNA水平较单药组增加(P＜0.05);而Bcl2、Bcl-xl无规律性改变。 对于甲基化相关基因DNMT1，DNMT3A，DNMT3B中，结果分析发现HHT对以上基因表达无明显下调作用（P＞0.05）;DAC可以下调以上基因，以DNMT1下降程度最大，小剂量组(0.4μmol/L)和大剂量组(4μmol/L)分别为0.350±0.084、0.811±0.712，DNMT3B其次，在DAC单药浓度组中，小剂量DAC(0.4μmol/L)与大剂量DAC组(4μmol/L)间差异有统计学意义（P＜0.05）;对于联合药物组中，联合组可以明显降低DNMT1表达0.275±0.147(P＜0.05)，未观察到DNMT3A有规律的改变。 Western blot检测发现药物联合组能明显降低Pro-Caspase-3的表达，且在高浓度联合组中较低浓度联合组明显，细胞株中未观察到Bcl2变化规律，Bcl-xl药物联合组较单药组中的表达明显减弱。可见到药物联合组中DNMT1、DNMT3B表达明显下调，而DAC单药组中，可见到DNMT1、DNMT3B表达下降。 DAC单药组中，DAC低剂量组(0.4μmol/L)和高剂量(4μmol/L)组分别可将LINE-

目录

摘要

1．背景

1．1 MDS的治疗现状

1．2 MDS表观遗传学改变

1．3 高三尖杉酯碱的研究现状

1．4 以地西他滨为基础的联合用药研究

1．4．1 DNMTIs的体外研究现状

1．4．2 地西他滨单药治疗存在的问题以及联合方案的优势

1．4．3 本研究实验目的

1．4．4 本实验研究对象以及相关指标说明

2．材料和方法

2．1 细胞株来源

2．2 主要仪器

2．3 主要试剂

2．4 主要试剂的配制

2．5 实验方法

2．5．1 细胞株的复苏、传代与冻存

2．5．2 细胞克隆形成实验

2．5．3 细胞活力实验

2．5．4 细胞凋亡和细胞周期的测定

2．5．6 蛋白电泳

2．5．7 实验所需细胞标本留取

2．5．8 目的基因mRNA表达水平检测

2．5．9 甲基化定量

2．6 统计学分析

3．实验结果

3．1 DAC和／或HHT对细胞株凋亡的影响

3．1．1 对细胞活力的影响

3．1．2 DAC联合HHT对细胞株克隆形成的影响

3．1．3 DAC和／或HHT的促凋亡作用以及协同作用

3．2 药物干预对细胞株细胞周期的影响

3．2 DAC联合HHT对SKM-1细胞株相关基因表达的影响

3．3 HHT和DAC干预后蛋白水平改变

3．4 去甲基化药物干预后基因组的甲基化程度改变

3．5 XAF1基因mRNA表达情况

3．6 XAF1甲基化改变

4．讨论

5．结论

参考文献

成果

致谢

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