骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤抗炎及免疫调节机制研究

摘要

背景：脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)是导致人口高死亡率和高致残率的主要原因之一。TBI后引起炎症联锁反应导致继发性脑损伤，其中炎症反应被认为是关键因素之一。TBI后脑组织细胞释放多种促炎因子和抗炎因子，介导炎症联锁反应的激活。TBI导致的强烈的炎症反应特点是:血脑屏障破坏后，外周白细胞浸润进入脑实质以及内源性免疫细胞的激活。外周浸入到脑组织的的中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等直接影响神经系细胞的存活和死亡。此外，脑组织内活化的小胶质细胞迁移到损伤部位，并释放细胞因子、趋化细胞因子、活性氧、一氧化氮、蛋白酶和其他具有细胞毒性作用物质，继而可能加重神经元死亡。 然而，这些免疫细胞和炎症介质也可以在TBI病理过程中起到神经保护作用。比如，T淋巴细胞在TBI的后期可能起到促进神经修复的作用。促炎因子IL-1、IL-6和TNF-a在对神经细胞的影响作用上都是具有双重作用，既有有害的一面也有有利的一面。另外，小胶质细胞在脑组织中能清除坏死的细胞碎片、促进脑神经细胞的重塑以及在某些特定的条件下发挥神经保护的作用。总之，TBI导致的炎症反应是继发性脑损伤中关键因素，这就表明我们可以通过抗炎或者免疫调节的治疗手段可能对TBI导致的一系列病理过程起到有效的治疗或保护作用。 以往的研究表明，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植治疗中枢神经系统（Central nervous system，CNS）损伤，包括TBI、中风和脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)的动物模型中发挥有益作用。这些研究的主要结果表明:干细胞促进神经功能的恢复，减少细胞凋亡，增加内源性细胞增殖，促进血管生成，减少病灶大小。移植的MSCs在CNS损伤中发挥有益作用的可能机制包括:MSCs具有迁移到损伤灶的能力;能分化成神经细胞，以取代受损的神经细胞;以及MSCs分泌的各种的生长因子发挥作用。然而，最近的证据表明， MSCs移植的治疗效果可能不是通过直接的细胞替代作用，而是通过调节宿主微环境发挥作用。MSCs可分泌多种生物活性分子，比如各种营养因子及多种抗凋亡分子，这些物质可能是发挥治疗作用的主要机制。 最近研究表明，MSCs具有免疫调节特性。MSCs可以直接抑制T淋巴细胞和小胶质细胞的增殖，并且可以影响树突状细胞和单核细胞和/或巨噬细胞分泌炎症因子。另外，MSCs还可以抑制中性粒细胞产生的活性氧化物质fMLP(甲酰基-甲硫氨基-亮氨酰基-苯丙氨酸)的活性。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型中，移植的MSCs能抑制髓鞘特异的T细胞并且诱导外周免疫耐受。移植的MSCs的免疫抑制效应也被证明在急性、严重的移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)和多系统萎缩(Multiple system atrophy, MSA)有效。此外，MSCs还可诱导外周耐受并且迁移到到受伤的组织，抑制促炎症细胞因子的释放，促进受损细胞的生存。这些作用在急性肺损伤、心肌梗死、急性肾功能衰竭、脑缺血及阿尔茨海默氏病中已经获得证实。一些研究还发现，其他干细胞也具有炎症调节功能。其中有一项研究证实，移植的人脐带血干细胞在大鼠中风模型中具有抗炎作用;另有一项研究报告，在中风超急性期通过静脉注射神经干细胞(Neuralstem cells，NSCs)，NSCs可通过与外周炎症系统相互作用调节脑内炎症反应。 这些研究提示，通过移植MSCs来减少脑组织炎症反应和调节TBI后的免疫反应具有可行性。然而，很少有研究同时关注MSCs对炎症相关的细胞因子和免疫细胞在CNS损伤的作用，尤其是在TBI模型中的这种研究更鲜有报道。因此，在本研究中，我们使用SD大鼠的TBI动物模型，通过静脉系统移植MSCs，探索MSCs在体内对TBI诱导的抗炎反应的抗炎作用及免疫调节性的特性，为深入理解MSCs移植治疗TBI机制提供实验基础。 第一章、大鼠骨髓MSCs的体外分离、培养与鉴定 目的：建立分离和培养大鼠骨髓MSCs的方法。 方法：从SD大鼠骨髓中生提取、分离、培养MSCs。当细胞生长达到80～90％融合时，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，进行传代、扩增。扩增的第3～8代MSCs用于进一步的检测或移植。使用流式细胞仪对MSCs的表型包括:CD44、CD90和CD105，以及造血干细胞标志物CD14、CD34、CD45和HLA-DR进行鉴定。 结果：流式细胞仪检测的第3代MSCs结果为，表型CD44(99.01％)、CD90(99.28％)及CD105(97.71％)高表达;造血干细胞表型CD14(0.79％)、CD34(0.78％)、 CD45(0.67％)及HLA-DR(1.11％)低表达。 结论：通过本研究，我们在体外成功建立了分离、培养MSCs的可靠方法。MSCs具有较强的体外扩增能力，细胞表型符合国际MSCs的标准，可作为干细胞移植治疗的理想种子。 第二章、创伤性脑损伤脑皮层中炎症相关免疫细胞和炎症因子的时间变化研究 目的：创伤性脑损伤(TBI)可诱导强烈的炎症反应，其可以持续数天至数月、导致严重的继发性脑损伤。然而，尚鲜见炎症相关免疫细胞与细胞因子在脑损伤过程中的动态关联变化情况，尤其少见TBI后炎症变化过程中其连续动态变化研究。 方法：本研究中，我们使用SD大鼠脑冲击伤的实验动物TBI模型，采用免疫组织化学技术检测炎症相关的细胞（中性粒细胞、T淋巴细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞）在脑组织内的聚集变化情况，同时应用multiplex assays检测系统，同步检测炎症相关的细胞因子（IL-1a、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1）在TBI后连续4周的变化情况。 结果：TBI后第7天，小胶质细胞和星形胶质细胞的数量达到高峰。MPO+中性粒细胞和CD3+淋巴细胞分别在TBI后第1天和第3天达到高峰。细胞因子IL-1a，TNF-a、IL-17、IL-10和TGF-β1均在TBI后第1天和3天增加，接着开始逐渐下降，到第28天又开始出现增加的趋势。趋化因子MCP-1、MIP-2和RANTES在TBI后第1天开始增加，随后逐渐下降，直到第28天达到最低值。IL-1β从TBI后第1天开始增加，第3天达到高峰，之后逐渐下降。IL-6在TBI后第7天才开始增加，在第28天达到高峰。IFN-γ在TBI后第14天到第28天才开始增高，并在第21天时达到高峰。IL-4从TBI后第14天才开始出现显著增加，持续到第28天仍处于增高水平。 结论：炎症相关细胞（星形胶质细胞、小胶质细胞、中性粒细胞及淋巴细胞）及其分泌的细胞因子（IL-1a、 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1）随着TBI时间的延长，出现不同的时间变化规律。 第三章、骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤的免疫调节机制研究 目的：有很多研究表明MSCs移植治疗脑损伤有效，其机制可能是通过MSCs转分化作用或营养因子分泌作用，但很少有研究者关注MSCs对炎症相关的细胞因子和免疫细胞在CNS损伤中的调节作用，尤其TBI模型中的该类研究。在本课题中，我们选用SD大鼠的TBI动物模型，通过静脉系统移植MSCs，研究MSCs在体内对TBI诱导炎性反应的抗炎作用及免疫调节性的特性。 方法：大鼠TBI后2小时，通过静脉移植MSCs。采用mNSS评分系统，评估TBI后第1、3、7、14、21和28天大鼠的神经运动功能情况。TBI后72小时，我们通过免疫组织化学技术来确定GFAP+星形胶质细胞、Iba-1+小胶质细胞/巨噬细胞、MPO+嗜中性粒细胞和CD3+淋巴细胞的密度。应用multiplex assays检测系统，同步检测脑皮层匀浆液中炎症相关的细胞因子(IL-1a、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a、 IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1)的浓度。采用逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹技术分别检测免疫抑制相关因素抗炎因子TSG-6和转录因子NF-κB的表达含量。 结果：MSCs治疗组mNSS分数从TBI后第3至28天相对于PBS治疗组明显下降。两组之间仅在TBI后24小时无显著差异。PBS治疗对照组和假手术组比较，PBS治疗对照组脑组织含水量明显升高;MSCs治疗组和PBS治疗对照组比较，MSCs治疗后显著降低脑组织含水量。MSCs治疗TBI后，受损的脑实质中小胶质细胞/巨噬细胞的激活有所减少，同时降低了脑组织损伤部位外周血白细胞浸润的数量，以及减少了部分促炎性细胞因子，同时增加了一些抗炎细胞因子的表达。此外MSCs能增强TSG-6的表达，并能抑制活化的NF-κB信号传导途径。 结论：TBI引起的炎症反应中，MSCs具有调节炎症相关的细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、 IL-17、TNF-a、IFN-γ、RANTES、MCP-1、MIP-2和TGF-β1)的释放及调节炎症相关免疫细胞（小胶质细胞、中性粒细胞及淋巴细胞）功能活性的能力。这一现象可能是通过MSCs增强TSG-6的表达、进一步抑制活化的NF-κB信号传导途径，从而降低促炎细胞因子而实现。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

一、引言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第一章 附图和说明

第二章 创伤性脑损伤脑皮层中炎症相关免疫细胞和炎症因子的时间变化研究

一、引言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第二章 附图和说明

第三章 骨髓间充质干细胞移植治疗脑损伤的免疫调节机制研究

一、引言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

五、结论

参考文献

第三章 附图和图片说明

全文总结

综述 骨髓间充质干细胞治疗中枢系统损伤的作用机制

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