动员后的同胞骨髓联合脐血移植治疗儿童重型β地中海血

摘要

背景：地中海贫血(thalassemia)是世界上最常见的遗传性血液病之一，因该病最早发现的病例是地中海沿岸地区的人而得名，也称为海洋性贫血。地中海贫血的分子基础是珠蛋白基因遗传缺陷导致珠蛋白肽链合成障碍，非α肽链（β、δ、γ）和α肽链合成比列失衡，进而引起红细胞破坏造成贫血、溶血和无效造血，其中α和β地中海贫血是最重要的地贫类型。重型β地中海贫血(β-thalassemiamajor)，亦称库勒贫血(Cooley' anemia)，为β0、β+基因纯合子或双重杂合子状态，临床以慢性进行性溶血性贫血、特殊面容、肝脾大及血红蛋白F明显升高为特征，是我国常见的一种地中海贫血，我国的高发区主要分布在长江以南各省区，尤以广西、广东和海南三省为高。 重型β地中海贫血是一种进展性疾病，目前常规治疗方法主要包括二个方面:(1)输血治疗。每10～30天1次，使血红蛋白(Hb)维持在90～120g/L，以纠正患者严重的贫血状态;(2)正确使用铁螯合剂。铁螯合剂能够防止并逆转过量铁质在组织细胞内的积蓄，同时减轻铁参与导致的自由基氧化损伤，延长地贫患者生命并改善生存质量。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的地贫儿童合理的治疗方法是每天持续皮下注射去铁胺(Desferrioxamine，DFO)至少10小时，每周至少5天，这种治疗的长期坚持性难于确定，现在也有两种口服去铁剂(去铁酮(Deferiprone，DFP)和地拉罗司(Deferasirox，DFX))，极大地改善了地贫患者在治疗过程中的依从性，但同样存在较明显的不良反应。尽管规律输血和去铁治疗使地贫患者的生活质量提高及生存期延长，但这一疾病最终还是导致患者早期死亡。死亡原因主要是:(1)慢性贫血及其并发症;(2)未适当使用铁螯合剂导致铁沉积病，长期输血导致的铁累积，加上贫血状态促进的胃肠道铁吸收，使得机体处于铁过载状态，进而引起慢性心脏、肝脏、内分泌系统损害等严重并发症。在中国，1名重型地中海贫血患者，如果接受正规输血及去铁治疗，每年的费用在5万元以上，尽管没有确切的统计数据，但临床实践表明，这些重型地贫病人因经济原因绝大多数得不到有效的治疗在15岁前死亡。即使给予正规的输血和去铁治疗，仍有高于50％的重型地贫病人在35岁前死亡。由此可见，重型β地中海贫血给家庭和社会造成严重的危害，对提高人口质量构成严重威胁。 自1982年Thomas等成功运用人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)全相合的同胞骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)治疗重型地贫以来，异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）开始被运用于治愈地贫。异基因HSCT是目前根治重型地贫唯一的治疗方法，已被医学界说普遍接受。通过HSCT治疗的重型地贫患者的生活质量明显高于传统输血和去铁治疗的患者。超过3000例重型地贫及镰刀细胞病患者通过HSCT得到治愈，其中大部分患者的造血干细胞来源于HLA全相合的同胞骨髓，造血干细胞移植应作为有HLA相合的同胞供者的重型β-地贫患者首选治疗方案。然而，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)目前仍然是造成骨髓移植失败和移植相关死亡的主要因素。同时，骨髓采集属于侵入性操作，对小供者来说创伤较大，若单纯采用骨髓，小供者可能不能耐受大量骨髓的采集。 脐血(umbilical cord blood，UCB)中含有大量的造血干细胞，脐血中CD34+细胞比例约占有核细胞的比例与骨髓相似。而且脐血具有来源广泛、采集方便，对产妇和新生儿无影响，不涉及伦理，GVHD发生率较低，能够克服HLA不相合障碍及污染率较低等优点。自1995年Issaragisil等首次应用脐血移植治疗重型β-地贫/血红蛋白E病(hemoglobin E disease，HBE)获得成功，脐带血很快被认为是重型地贫HSCT很好的来源。脐血移植用于治疗重型β-地贫主要障碍有植入率低和造血及免疫重建延迟。单份脐血中造血干细胞(hematopoietic stemcell，HSC)数量有限，脐血每单位含有单个核细胞数为骨髓(bone marrow, BM)的1/10，而地中海贫血是骨髓增生活跃，且长期输血引起的异基因免疫反应，移植时要求有核细胞数(total nucleated cells，TNC)数量大才容易植入。为克服脐血移植后植入困难，目前所采用的措施有脐血的体外扩增、双份脐血输注、联合输注（骨髓+脐血，间充质干细胞+脐血等）方式。 南方医科大学附属南方医院儿科移植中心自20世纪90年代开始采用造血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血。由于中国重型地贫患者去铁情况多不正规（港台地区除外），患者的状况较差，而卫生资源有限，需探索出一条符合中国特色的重型地中海贫血HSCT的可行之路。近几年来，我们努力专注于改善HSCT的安全性及HSC的可用性。重型地中海贫血移植失败的最常见原因是移植物排斥，基于这项研究，减少移植排斥率(graft rate，GR)的尝试通常涉及更强的移植前预处理方案和提高骨髓中造血干细胞数量。本文将我中心自2008年3月自2012年10月共4年半所完成的动员后的同胞骨髓联合脐血混合移植治疗30例重型β-地中海贫血患儿结果进行回顾性总结，报告如下。 对象与方法:本项研究包括在南方医科大学附属南方医院儿科自2008年3月自2012年10月接受动员后的同胞骨髓联合脐血混合移植治疗30例重型β-地中海贫血患儿。30例地贫患儿均作了地贫基因检查，基因型为β地贫基因纯合子或双重杂合子，其中男17例，女13例，中位年龄6.7岁（年龄范围在3.8-12.3岁），均为单次移植。移植前30例重型β-地贫患儿都按国内地贫临床分度（根据年龄、肝大情况和铁蛋白水平分为三度），类似于Pesaro分度，其中4例为Ⅰ度，24例为Ⅱ度，2例为Ⅲ度，30例患者中29例符合HLA低分辨6/6全相合（HLA-A，-B，-DR），1例为HLA-A位点不相合。 预处理方案:环磷酰胺(Cyclophosphamide，Cy,50～60mg/kg/d,-10d～-9d);白消安（Busulfan，Bu，2.8～4.4mg/kg/d，-8d～-6）;氟达拉滨(Fludarabine，Flu，40mg/m2/d,-8d～-4d);噻替哌(Thiotepa, TT,10mg/kg/d,-5d);兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（Thymoglobulin，2.5mg/kg/d，-3d～-1d）;上述药物联合运用组成预处理方案。 骨髓和脐血的采集与输注:在地贫患者母亲再次妊娠至妊娠18～22周抽取羊水进行产前诊断和HLA配型，分娩时收集脐血冷冻保存;同时在采集后行各类细菌、病毒等病原学检测及有核细胞、流式细胞仪行CD34+细胞含量测定。骨髓采集时供者年平均为2.3岁（1.2～4.6岁），于采集前4天开始给予粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)10μg/kg/d对骨髓进行动员，在移植当天在全麻下从髂后上棘抽取。在预处理完成后，次日行造血干细胞移植物输注，输注造血干细胞当天称为0天。移植当天先将供者体内采集的骨髓造血干细胞直接从中心静脉尽快输入，次日上午输注脐血干细胞。30例病例输注TNC平均为2.86×108/kg(范围在1.84～4.04×108/kg)，其中脐血TNC平均为0.39×108/kg(范围在0.27～0.71×108/kg)，输注CD34+细胞数平均为8.10×106/kg(范围在1.15～24.4×106/kg)。 并发症的防治:(1) GVHD预防:本组病例GVHD预防方案为:环孢霉素A移植前-10天自-2天予1.5mg/kg/d静脉滴注，移植前-1至移植后+25天剂量增至3mg/kg/d静脉滴注，1月后静脉滴注改为口服，根据浓度调整环孢素A口服量，使其血药浓度维持在使维持200±50ng/ml，移植2月后开始减量至停药;霉酚酸酯移植后+1天予15mg/kg/d连续口服至30天停药;甲氨蝶呤移植后+1、+3、+6天分别予10～15mg/m2静脉滴注，一旦发生GVHD，根据GVHD程度加用激素或（和）免疫抑制剂。(2)肝静脉闭塞病(veno-occlusive disease，VOD)预防:本组给予肝素和熊去氧胆酸预防VOD，肝素通常剂量为100～200u/kg/d持续静注，在无出血倾向的情况下维持部分凝血活酶时间(activated partialthromboplastin time，APTT)轻度大于正常，发生VOD时，予利尿剂等治疗。(3)出血性膀胱炎(Hemorrhagic cystitis，HC)预防:本组病例预处理前6h开始水(3L/m2/d)，保证尿量大于60～100ml/m2，静脉输注环磷酰胺的同时运用美司，治疗采用水化、血小板输注，必要时膀胱冲洗。(4)感染预防:移植前清除龋齿等感染灶，进入层流病房前静脉应用更昔洛韦预防巨细胞病毒感染，入住层流无菌病房，口服肠道除菌药物等处理。预防真菌感染采用伊曲康唑从+5天开始口服至粒细胞大于0.5×109/L后3天停药。出现发热等感染症状时，根据经验及早选择有效足量的广谱抗生素。 观察指标和定义:(1)造血重建。中性粒细胞(Neutrophil count，ANC)植入为连续三天中性粒细胞数＞0.5×109/L，血小板(Platelet，PLT)植入为在没有输注血小板情况下连续7天血小板＞20×109/L，血红蛋白植入（Hemoglobin，Hgb）为在没有输注红悬情况下连续3天血红蛋白＞80g/L;(2)移植相关并发症。GVHD诊断按照Glucksberg和Przepiorka的分级系统;VOD的诊断按照Baltimore诊断标准;植入证据用原位免疫荧光杂交法(Fluorescence In SituHybridization，FISH)检测性染色体的转变（供受者性别相同）、短串重复序列聚合酶链反应(Short tandem repeat-polymerase chain reaction，STR-PCR)（供受者性别不同），并定期复查;原发性植入失败定义为供者移植物输注28天后无供者来源的造血重建;移植物排斥指移植后的重型地贫患者在任何时候恢复地贫状态。 统计分析:运用SPSS13.0统计软件分析。采用Kaplan-Meier法估计总生存率、无病生存率以及移植相关死亡率并用百分比表示。 结果：生存情况:30例重型β地中海贫血患几，29例移植后成功植入，1例恢复地贫状态，移植排斥率(GR)为3.3％。截至2013-12-31，中位随访时间43.3个月（范围在13-68个月），27例存活，26无病存活，估计5年总生存率(overallsurvival，OS)为90.0％，地贫无病存活率（Thalassemia-free survival，TFS）为86.5％。本组病例死亡3例，移植相关死亡率（transplant-related mortality, TRM）为10.0％，其中2例死于住院期间，1例死于严重的VOD，1例死于由感染引发的呼吸衰竭和心脏衰竭，第3例在移植后第7个月死于感染及呼吸、心脏衰竭。 造血重建:对于29例移植后成功植入，中性粒植入时间为16天（范围11～28天），血小板和血红蛋白植入时间为22天（范围9～39天）和25天（范围10～48天），其中1例患儿死亡时，血小板仍未达20×109/L。 移植相关并发症:在29例成功植入的患儿中，有7例发生急性GVHD，其中有6例Ⅰ度GVHD和1例Ⅲ度GVHD，急性GVHD以皮肤型为主，急性Ⅲ度GVHD发生率为3.3％，没有出现

目录

摘要

第一章 前言

第二章 研究对象

2．1 基本情况

2．2 移植前治疗情况

2．3 分度标准

第三章 研究方法

3．1 病人移植前准备

3．2 造血干细胞采集

3．3 造血干细胞移植

3．4 随访

3．5 统计分析

第四章 结果

4．1 生存情况

4．2 造血重建

4．3 移植相关并发症

4．4 死亡原因

第五章 讨论

5．1 生存情况

5．2 造血重建

5．3 并发症情况

第六章 结论

参考文献

综述 脐血干细胞移植治疗重型β-地中海贫血的进展

中英文缩略词表

成果

致谢

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