MLPA技术检测矮小儿童GH受体及信号通路相关基因的研究

摘要

研究背景: 身材矮小(short stature)是指在相似环境下，儿童（或成人）的身高较正常的同种族、同年龄、同性别的人群身高均值低2个标准差（-2SD）以上或处于第3百分位以下。目前矮小症的主要病因分为两大类，垂体性疾病（如生长激素缺乏症、生长激素分泌障碍、多种垂体激素缺乏症、颅内腺瘤）和非垂体性疾病，非垂体性疾病又可分为特发性矮小、家族性矮小、宫内发育迟缓、青春期发育迟滞、营养不良及微量元素疾病（如锌缺乏、铅中毒）、非垂体性内分泌疾病、遗传代谢性疾病、全身疾病等。在矮小症病因中，居前两位的高频病因为生长激素缺乏及特发性矮小。 生长激素(growth hormone GH)是一种由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的由191个氨基酸组成的单链亲水球蛋白，具有促进生长，调节骨代谢及物质代谢等作用，是人体生长不可缺乏的成分。生长激素的合成和分泌受下丘脑生长激素释放激素和生长激素释放抑制激素的双重控制。生长激素缺乏症(growthhormone deficiency GHD)是指垂体前叶生长激素缺乏或分泌不足所致的生长障碍，可分为单纯性生长激素缺乏或伴多种垂体激素缺乏。 特发性矮小(idiopathic short stature，ISS)是一种暂时尚无明确原因的矮身材，可能是一种多基因疾病，临床上无GH缺乏和明显的进行性病理改变，可能包括GH不敏感、(normal variant short stature)、GH神经分泌功能紊乱（growthhormone neurosecretory dysfunction GHND）、特发性生长障碍和非GHD性身材矮小等。ISS是儿童矮小症的常见类型，ISS患儿出生体重和生长激素分泌正常，其发病率在矮小儿童中约占60％～80％。 生长激素主要通过以下方式起作用:1、与生长激素受体(GHR)结合直接发挥作用;2、与GHR结合启动STAT（STAT1，STAT3，STAT5A，STAT5B）或MAPK或PI3K-AKT等信号转导通路，从而刺激胰岛素样生长因子(IGF)分泌，以达到促进生长及调节物质代谢的作用，即GH-IGF轴。酪氨酸激酶—信号转导和转录激活因子（JAK-STAT）途经是GHR的重要信号通路，GH与GHR结合后主要激活JAK家族中的JAK2。编码JAK2的基因在9号染色体(9p24)。STAT是另一个重要的信号通路分子，STAT的活化需要GHR和JAK2分子上一些特异的区域，需要JAK2和GHR胞浆区的相互作用。STAT5b是人类生长发育最密切的通路分子，其基因位于17q21.2，含有19个外显子。 促丝裂素原激活的蛋白激酶(MAPK)是生长激素的另一条重要的信号通路，其激活方式是一个三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinasekinase，MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase，MKK)和MAPK，这三种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。生长激素受体还可以激活PI3K-AKT通路，首先PI3K在已激活的生长激素受体的作用下激活并在细胞膜产生3，4二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇，AKT在二磷酸磷脂酰肌醇的作用下产生同二聚体并达到部分激活的状态，而二聚体进一步增强了AKT的活性，最后活化的AKT随后由细胞膜上释放下来，使其得以到细胞浆内继续传递生物学信号用。 对于身材矮小的基因研究多数研究者选择直接测序法，但矮小的病因繁多，且一种病因所涉及的基因片段也高达数十甚至上百个。选择直接测序法不仅经济上花费巨大，人力物力也是不小的支出，且对于大片段的基因杂合缺失可能不表现出异常结果。 多重连接探针扩增技术(multiple ligation— dependent probe amplificationMLPA)技术是2002年由荷兰的Schouten等发明的一种建立在DNA探针杂交和PCR技术上的针对待测核酸中靶序列进行定性和半定量的高通量分析技术。MLPA技术仅需少量的DNA，主要通过变性、杂交、连接和扩增等四个过程，在同一反应管中同时检测高达40多个核苷酸序列拷贝数变化，并进行定量分析检测。可根据MLPA图信号值的改变判断靶序列是否有点突变或拷贝数的异常。 实时荧光定量PCR(Realtime fluorescent quantitative PCR)是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术。该技术通过荧光信号的积累来实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全部处在封闭的条件下进行，从而具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，极大的克服了原有PCR技术的小足。本实验中运用荧光定量PCR是用于验证MLPA的结果及试图缩小异常基因范围，为后期明确具体突变位点打下基础。 研究目的及意义: 本课题采用荷兰MRC—Holland公司提供的分析GH受体及信号通路相关基因的试剂盒(SALSA MLPA KIT P262)，同时检测特发性矮小(ISS)患儿、生长激素缺乏(GHD)患儿及正常对照儿童11个GH受体基因片段及35个GH受体后信号通路等基因片段，以了解身材矮小患儿GH受体及信号通路相关基因的缺失、重复及其点突变情况。对MLPA结果异常者进行进一步的实时荧光定量PCR检测和家系调查。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法（试剂盒由美国DSL公司提供）测定血清胰岛素样生长因子（IGF-1）浓度，探讨基因突变对IGF-1的影响。 研究方法: 对象:①选择2012年3月-2013年3月至深圳市妇幼保健院就诊的矮小儿童96例，年龄4-13岁，男52例、女44例，根据身高低于同性别同年龄均值-2～-3SD，排除其他疾病导致的身材矮小，根据生长激素激发试验，GH峰值＜10ng/ml，为生长激素缺乏症(GHD)组共67例、GH峰值＞10ng/ml为特发性矮小(ISS)组共29例，另选择同期体检的生长发育正常儿童23例作为正常对照，年龄4-13岁，男13例、女10例。GHD组、ISS组与对照组性别比较差异无统计学意义。②对已诊断为特发性矮小且发现其MLPA结果异常2例同胞姐弟及1例女性患儿，进行两家系调查，分别收集其家庭成员12人及6人。 测量指标: 对所有研究对象均记录其性别、年龄，出生体重、身长，测量清晨8点左右空腹身高、体重，对身材矮小患者行生长激素激发试验、甲状腺功能、肝肾功能、微量元素、骨龄及头颅核磁共振、染色体等检查。 标本采集及实验室检测: MLPA基因检测:采集所有研究对象的外周静脉血3ml，枸橼酸二钠抗凝，常规苯酚氯仿法提取基因组DNA，应用MRC— Holland公司的P262试剂盒，进行DNA变性、探针杂交、连接反应、扩增及数据分析。 荧光定量PCR检测:取MLPA结果异常患儿及健康对照组正常儿童外周血3ml，常规苯酚—氯仿法提取基因组DNA后进行DNA结合染料SYBR GreenⅠ的方法进行荧光定量PCR。所采用的荧光定量PCR试剂为ABI SybrGreen PCRMaster Mix(2X)，所采用的荧光定量PCR仪为ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪，在配制反应混合液完成后，设定PCR循环条件，进行PCR循环。制作内参基因、标本基因扩增曲线及溶解曲线，计算Ct值、2-(△△Ct)。 血清IGF-1测定:采集所有研究对象的外周静脉血3ml，分离血清后，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定IGF-1浓度，操作按说明书，批内、批间变异系数达要求范围。 统计学处理:采用SPSS17.0软件进行统计分析，以Hardy— Weinberg平衡检验确定样本的群体代表性。计数资料采用R×C表x2检验，理论频数＜5时采用Fisher精确概率法，计量资料以(x)±s表示，多个样本均数间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1、MLPA技术检测身材矮小儿童GH受体基因情况: 所有研究对象的GHR基因外显子(Ex)1～10均未发现信号升高，Ex1、2和4～10也未发现信号降低或缺失等异常情况;GHR外显子3位于MLPA图谱第30个基因扩增峰，其信号降低和完全缺失的发生率分别在GHD组为34.3％、1.5％，ISS组为17.2％、3.4％，对照组为26.1％、8.7％。三组儿童GHR基因Ex3基因型及等位基因频率的差异均无统计学意义，P均＞0.05。三种GHR Ex3基因型儿童血清IGF-1水平的差异无统计学意义，P＞0.05。 2、MLPA技术检测身材矮小儿童GH受体后信号通路等基因突变情况: 所有研究对象的针对JAK2（1-7、9、12、14、16、19、21、23、25外显子）、STAT5b(1-4、7、12、13、15、16、18、19外显子)和IGF-1（1、3、4、6外显子）的特异性探针检测均未发现信号异常;STAT5b基因的第6外显子5'端内含子区域（后文简写为STAT5b Ex6）信号位于第36个基因扩增峰，在ISS组有3例患儿此信号强度与正常人信号的比率小于0.6，为2例同胞姐弟及1例女性患儿，检出率为10.34％（共3例），在GHD组及正常对照组均未发现该片段信号降低。 3、实时荧光定量PCR检测结果: 对3例MLPA显示STAT5b基因的第6外显子信号异常患儿及正常对照组儿童，进行STAT5b基因的第6外显子5'端内含子区域的扩增及实时荧光定量PCR，荧光定量PCR检测结果提示患者DNA该区域的表达量为正常对照组表达量的0.395，低于参考标准数值0.6，验证该基因为杂合突变。 4、STAT5b EX6基因缺失家系调查: ①家系Ⅰ共有成员12名，其中7名成员（男3例，女4例）GHR Ex6基因型与先证者一致，有4例身高低于同性别同年龄均值-2SD、2例低于同性别同年龄均值、1例身高正常。 ②家系Ⅱ共有成员6名，其中3名成员（男2例，女1例）GHR Ex6基因型与先证者一致，有1例身高低于同性别同年龄均值-2SD、2例低于同性别同年龄均值。 结论: ①应用MLPA技术检测生长激素受体基因结果显示GHD组、ISS组和正常对照组均发现有GHR基因外显子3信号降低及完全缺失，三组儿童GHR基因Ex3基因型及等位基因频率的差异均无统计学意义，各基因型的IGF-1水平也无明显差异，考虑GHR基因外显子3信号降低及完全缺失为基因在人群中的多态性分布。 ②应用MLPA技术检测生长激素受体后信号通路等基因结果示:特发性矮小患儿中发现编码STAT5b蛋白的第6外显子5'端存在基因缺失，而在生长激素缺乏症和正常儿童中未发现。鉴于STAT5b基因纯合突变可导致身材矮小，该基因杂合突变可能与患儿身高受损有关。 ③STAT5b Ex6基因杂合缺失家系调查:两家系成员共18例，有10例STAT5b Ex6基因型与先证者一致，其中9例身高低于同年龄同性别均值（占90％），5例身高低于同年龄同性别均值-2SD（占50％）;10例中儿童4例（身高均低于同年龄同性别均值-2SD）、成人6例（5例身高均低于同年龄同性别均值，其中1例低于同年龄同性别均值-2SD;4例血IGF-1水平明显低下），提示STAT5b Ex6基因杂合缺失对儿童身高和成人终身高以及成人IGF-1水平均有一定的影响，其生物学功能有待进一步研究。

目录

摘要

前言

第一章 MLPA技术检测身材矮小儿童生长激素受体基因

1．1 引言

1．2 材料与方法

1．3 结果

1．4 讨论

第二章 MLPA技术检测身材矮小儿童生长激素受体后通路基因

2．1 引言

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 STAT5b Ex6基因缺失家系调查

3．1 引言

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

结语与展望

参考文献

中英文缩略词对照表

成果

致谢

声明

生长激素不敏感综合症相关基因的研究进展