铸造前后钛及钛合金生物相容性的研究

摘要

背景:由肿瘤切除、外伤、炎症及先天畸形所致的颌骨缺损，往往伴随周围重要结构的破坏或缺失，不仅影响外形，而且直接影响语言、咀嚼、吞咽、呼吸等多项生理功能，如不修复，会遗留严重的面部畸形和功能障碍，影响患者的身心健康和生存质量。因此，如何修复和重建颌骨缺损，恢复其功能以及改善颌面部畸形是口腔颌面外科和修复科研究的热点。 目前临床上应用较多的颌骨缺损治疗方法包括赝复体修复、自体骨游离移植、同种异体骨移植、血管化自体骨肌（皮）瓣移植、个性化钛支架、牵引成骨术以及骨组织工程技术等。个性化钛支架，这项技术能够根据患者自身面型设计还原各种复杂的实体，能够较理想地恢复面部美观和生理性功能，支架设计成孔状，空腔的结构，比重较轻不会给附着骨块带来过重负担，便于组织长入，与之紧密结合，并且还有较好的支撑作用，同时钛支架内部可以种植义齿部分恢复患者的咀嚼功能，不仅提高了手术效果、改善了患者的生存质量，也反映了时代发展的要求，是值得临床推广应用的手术方式。 个性化钛支架的发展依赖于快速成型技术。快速成型技术(rapid prototyping，RP)，是基于离散—叠加原理而实现快速加工原型零件的。首先建立三维CAD(Computer Aided Design，计算机辅助设计)模型，然后对其切片分层（一般为Z向），得到离散的许多平面，把这些平面的数据信息传给成型系统的工作部件，控制成型材料有规律地、精确地、迅速地层层堆积起来而形成三维的原型，经处理后成为零件。从成型的角度来说，零件可以视为一个空间实体，它是点、线、面的集合。RP的成型过程即是体—面—线的离散与点—线—面的叠加过程，即三维CAD模型—二维平面（实体）—三维原型的过程。当前比较成熟的快速成型技术有十几种，SLA（立体光固化成型）技术在口腔医学方面的应用最为普遍。以光敏树脂（如丙烯基树脂）为原料，紫外激光以预定原型各分层截面的轮廓扫描，光聚合固化，最后将设计满意的修复体树脂模型经精密铸造，翻模加工成钛支架，然后对支架进行喷沙、抛光、清洗处理。 铸件的生物相容性取决于其元素构成、金相结构，钛及钛合金在高温熔铸过程中，在元素构成及金相结构方面将产生以下变化:如低沸点组分在高温下挥发造成该组分损失;合金中卷入气体元素;合金结晶过程中溶质再分配造成的显微偏析等。钛及钛合金在高温状态下化学性质非常活泼，铸造时易与氧、氢、氮等元素发生化学反应，同时也易与包埋材料发生化学反应。铸模温度越高，熔融钛液越容易与包埋材料（铸型材料）发生反应，所形成的反应层越厚。反应层的存在会影响义齿的精度，并且改变了钛及钛合金的性能和元素结构，增加了杂质元素存在的风险，进而影响其生物相容性，因此铸件表面反应层的处理也显得尤为重要。本试验在确定包埋料及铸钛系统的情况下，对铸造后的钛材料进行常规技工室机械抛光后，测定其生物相容性，为铸造支架材料在口腔颌骨缺损中的植入应用提供试验依据。 目的:通过细胞毒性试验、口腔黏膜刺激试验和迟发致敏试验探讨铸造后经机械抛光的纯钛和钛铝钒合金的生物相容性。 试验一:细胞毒性试验 材料与方法: 1.将铸造前A组（纯钛）、B组（钛铝钒合金）材料切削制成直径13.5mm、厚度1mm的圆片，每组15片试样。用牙科蜡片制作15片50×50×1mm的长方体，按铸造要求安插铸道，运用离心浇铸法分15次精密铸造，氧化锆系包埋料为内包埋料，磷酸盐系包埋料为外包埋料。完成铸造后30min内取出铸型，自然冷却铸型，当铸型完全冷却后分离铸件与型壳。铸造后钛材C组（纯钛铸造后）、D组（钛合金铸造后）用笔式喷砂机喷砂(Al2O3砂，粒度180μm，压力0.4MPa，距离4-5cm)去除表面反应层，每个试件处理30s。按照包埋料说明书上的推荐，依次用钨钢钻、1200目砂纸圈、橡皮轮、毛刷以及绒轮蘸抛光粉进行试件低速（不高于10000转/分）打磨抛光，肉眼观察达到镜面效果为止。线切割出直径13.5mm、厚度1mm的圆片，超声清洗，消毒后按3cm2/ml试样面积与浸提液量的比例在37℃、含体积分数5％ CO2培养箱中浸提72 h获取浸提液。阴性对照E组为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，阳性对照F组为含5％ DMSO的DMEM高糖培养基。 2.复苏冻存的L-929细胞，传代培养，选取对数生长期细胞，计数和稀释后以血清DMEM高糖培养基将其配制成1000个细胞每毫升的单细胞悬液，设置6组，每组设6孔，将细胞悬液以100μl每孔接种于96孔板，同法接种3块板，分别于浸提液培养细胞1、3、5d后观察细胞生长形态并用MTT法测定各组细胞吸光度值。采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，数据以均数±标准差表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果: 1.各观测点，4个试验组和阴性对照组的L929细胞形态大体相似，浸提液培养第1天细胞贴壁生长，形态良好，呈梭形或多角形，细胞突充分伸展，并见圆形的分裂状态细胞，胞浆内有离散颗粒;第3天时细胞融合占孔底约40％，第5天时细胞融合占孔底约70％，铸造前后钛及钛铝钒合金4组材料细胞吸光度值与阴性组之间无显著性差异(P＞0.05)。 2.A与C组、B与D组同一钛材铸造前后比较吸光度值无显著性差异（P＞0.05），铸造前、后两种材料A与B、C与D两组之间吸光度值比较也无显著性差异(P＞0.05)。 试验二:口腔黏膜刺激试验 材料与方法: 1.将A（纯钛）、B（钛合金）组切削制成直径5mm、厚1mm的圆片，圆片中央制备1个直径1mm的圆孔，以便缝线穿通。用牙科蜡片制作10片50×50×1mm的长方体，按铸造要求安插铸道，运用离心浇铸法分10次精密铸造，氧化锆系包埋料为内包埋料，磷酸盐系包埋料为外包埋料。完成铸造后30min内取出铸型，自然冷却铸型，当铸型完全冷却后分离铸件与型壳。C（纯钛铸造后）、D组（钛合金铸造后）铸造后，用笔式喷砂机喷砂(Al2O3砂，粒度180μm，压力0.4MPa，距离4-5cm)去除表面反应层，每个试件处理30s。按照包埋料说明书上的推荐，依次用钨钢钻、1200目砂纸圈、橡皮轮、毛刷以及绒轮蘸抛光粉进行试件打磨抛光，肉眼观察达到镜面效果为止。线切削出直径5mm、厚1mm的圆片，圆片中央制备1个直径1mm的圆孔，每组10个样品，水洗，吹干后消毒备用。阴性对照E组为牙胶，阳性对照F组为工业用聚氯乙烯（含有机锡），规格同上，数量各20个。 2.将各组试验材料用5/0缝合丝线进行穿颊及皮肤缝合，缝合在健康无病变的仓鼠颊囊上，试验组每组10只动物中，左右侧各为一组，一侧缝合试验组，对侧组中各5只缝合阴阳对照组。2周后，取出试样，肉眼观察颊粘膜有无异常情况，取出试样后，腹腔麻醉下无痛处死仓鼠，切取与试样接触及其周围的颊粘膜与皮肤全层组织，固定包埋，制取病理切片。 结果: 1.2周后大体观察，试验组4组中只有铸造后钛合金D组有2只仓鼠黏膜轻度红斑，其余无异常反应，与阴性对照组结果相同。 2.病理切片观察，D组2个试样的组织学结果中存在结缔组织炎细胞浸润、血管轻度充血、组织水肿的轻度反应现象，其余试验组组织学结果均显示上皮连续、完好无损，无细胞变形，无溃疡、糜烂，细胞层次清楚，排列均匀，结缔组织少量炎细胞浸润、组织水肿、血管充血，与阴性对照组结果相同。 试验三:迟发致敏试验 材料与方法: 1.钛材料成分、分组、制作及抛光同试验一，按试样面积与浸提液量的比率为3cm2/ml，将材料浸入生理盐水，制取浸提液。阴性对照E组为生理盐水，阳性对照F组为95％乙醇配制的2，4-二硝基氯苯溶液。 2.皮内诱导阶段，每组10只白化豚鼠，每只动物去毛的肩胛骨内侧部位成对皮内注射0.1ml相对应试剂。1周后，局部诱导阶段，按照选定试剂浓度浸透滤纸，将20mm×40 mm滤纸浸透后贴敷于诱导注射点，保鲜膜覆盖，胶布包扎固定，48±2h后去除胶布和滤纸片。半个月后，局部激发阶段，用选定的激发阶段的浓度，浸透滤纸片，贴敷于每只豚鼠的单侧腹部，48±2h后去除胶布和滤纸片，去敷贴后24h观察试验组和对照组动物激发部位的皮肤情况。 结果: 1.四组试验组结果与阴性对照组相同，各动物在去除敷料后24h的观察结果均无红斑、无水肿。 2.阴性对照E组:各动物在去除敷料后24h的观察结果为无红斑、无水肿。 3.阳性对照F组:各动物在去除敷料后24h，3只反应均为中度红斑，中度水肿，另外2只无红斑、无水肿。 结论: 1.试验条件下，铸造后经机械抛光的钛及钛合金对L-929细胞无毒性刺激，不影响细胞正常生长。 2.试验条件下，铸造后经机械抛光的钛及钛合金对金黄地鼠口腔黏膜无刺激反应。 3.试验条件下，铸造后经机械抛光的钛及钛合金对豚鼠无致敏反应。 4.纯钛及钛合金经铸造后机械抛光至表面肉眼可见光滑，可以得到生物相容性良好的支架，为个性化钛支架临床应用提供了试验数据。

目录

摘要

前言

1 颌骨缺损修复概述

2 快速成型术在颌骨缺损修复中的应用

3 钛材铸造后表面反应层及抛光对生物相容性的影响

试验一 细胞毒性试验

1 材料

2 方法

3 结果

试验二 口腔黏膜刺激试验

1 材料

2 方法

3 结果

试验三 迟发致敏试验

1 材料

2 方法

3 结果

讨论

全文小结

参考文献

英文缩略词

攻读学位期间主要的研究成果

致谢

声明