二次谐波和双光子激发荧光(SHG/TPEF)显微成像技术诊断肾脏纤维化的系统研究

摘要

本研究拟建立移植肾慢性排斥模型、移植肾急性排斥模型、环孢素肾病模型、单侧输尿管梗阻模型这4种不同病因的大鼠肾纤维化模型，并使用非线性光学显微镜扫描标本并观察胶原纤维的动态变化，为今后建立计算机软件辅助的肾纤维化精确诊断和分级系统提供原始的胶原蛋白结构数据参数。
　　第一部分SHG/TPEF显微成像技术诊断人移植肾纤维化的研究
　　目的:评估SHG/TPEF显微成像技术用于诊断人移植肾间质纤维化的可行性;比较SHG/TPEF显微成像技术与传统病理染色相比对肾脏早期纤维化评估的敏感性;验证SHG/TPEF显微成像技术在不同时间或不同观察者之间的可重复性;比较SHG/TPEF显微成像技术与Masson染色技术评估人移植肾皮质纤维化比例的差异;将Masson染色图片和SHG/TPEF图片测算出来的皮质纤维化比例根据Banff07标准进行分级评分，比较分级的一致性，评价SHG/TPEF成像用于评估人移植肾间质纤维化可靠性。
　　方法:2011年1月至2013年3月间我院共行143例移植肾活检术。按随机原则从中抽样50例石蜡样本，其中8例诊断为不合格标本，共有42例标本纳入研究。按照传统病理诊断将标本分为2组:轻度纤维化组24例，中重度纤维化组18例。将入选的石蜡标本连续2张切片，每张5μm，第1张切片行HE染色，第2张切片无需特殊染色，直接使用SHG/TPEF设备将白片扫描成像后，再将该标本行Masson染色。使用SHG/TPEF显微镜扫描切片，评估该技术用于观察人肾脏皮质内胶原纤维的可行性。使用SPSS17.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用信度分析检验SHG/TPEF技术在同一时间不同观察者之间的可重复性，采用可重复测量的方差分析检验SHG/TPEF技术在不同时间点同一观察者的可重复性。将轻度纤维化组中标本的SHG/TPEF图像与Masson染色图像进行对比，验证SHG/TPEF成像评估早期肾纤维化的敏感性。在获得42例标本的Masson染色及SHG/TPEF图像后，使用Image-Pro-Plus(6.0版)软件计算两组图像的皮质纤维化比例，采用配对样本t检验验证Masson染色和SHG/TPEF两种方法算出的皮质纤维化比例之间的差异，以P<0.05为有统计学差异。以上述2种方法测算出的皮质纤维化比例为依据，根据Banff07标准进行分级评分，采用Kappa检验比较纤维化分级评分的一致性，当kappa值>0.75代表一致性好，0.40≤ kappa值≤0.75代表一致性较好，kappa值<0.4代表一致性差。
　　结果:人移植肾标本经非线性光学显微镜扫描后，可获得清晰的TPEF和SHG图像，证实了人移植肾脏组织存在非线性光学现象。可重复测量的方差分析显示:同一观察者、不同时间点的SHG/TPEF图像的皮质纤维化比例无统计学差异（F=6.545，P=0.063）;信度分析显示:同一时间、不同观察者之间的SHG/TPEF图像皮质纤维化比例的信度有高度一致性(ICC=0.998，P<0.001)，表明SHG/TPEF技术在不同观察者之间、不同时间可重复性高。对比轻度纤维化组标本的Masson染色和SHG/TPEF图像，发现病变早期时肉眼未能发现Masson图像中的胶原纤维，而在SHG/TPEF图像中可清晰分辨出胶原纤维，证明SHG/TPEF成像灵敏度高于Masson染色。采用配对样本t检验发现使用SHG/TPEF及Masson染色两种方法评估皮质纤维化比例无统计学差异(t=-1.703，P=0.096)，表明SHG/TPEF纤维化比例与Masson纤维化比例一致性良好。用Kappa检验比较基于上述两种纤维化比例的Banff分级是否一致，发现其kappa值为0.845（P<0.001），表明基于SHG的纤维化比例和Masson纤维化比例进行的Banf分级一致性好。
　　结论:SHG/TPEF显微成像技术用于观察人移植肾纤维化具有可行性;与Masson染色技术比较，SHG/TPEF显微镜对肾脏早期胶原纤维的分辨更敏感;使用SHG/TPEF评估肾皮质纤维化比例与Masson染色相比无显著差异;基于SHGSHG/TPEF进行的Banff纤维化分级评分与Masson染色分级评分相比一致性好;SHG/TPEF显微成像技术可重复性高，受时间及观察者之间的差异影响小，对胶原纤维特异性高，是一种很有潜力的诊断肾间质纤维化的新技术。
　　第二部分4种大鼠肾脏纤维化模型的建立以及用SHG/TPEF技术观察
　　大鼠肾脏胶原纤维的研究
　　目的:建立大鼠肾移植慢性排斥模型、大鼠肾移植急性排斥模型、大鼠环孢素肾病模型、大鼠UUO模型这4种不同病因的大鼠肾脏纤维化模型，并使用SHG/TPEF显微成像技术对不同模型中不同时段的大鼠肾脏标本进行扫描，观察胶原纤维在不同病因模型中的类型、发生、发展及分布情况。
　　方法:建立大鼠肾移植慢性排斥模型，以2只SD大鼠为正常对照组，分别取双肾作为对照，以12只Wista大鼠为供者，取其双侧肾脏，以24只SD大鼠为受者，将供者左、右侧供肾分别随机移植给24只SD大鼠（慢排组），术后持续给予肾移植大鼠环孢素A注射液(2mg/kg.d-1)腹腔注射，随机于肾移植术后2周（2W组）、4周（4W组）、6周（6W组）、8周(8W组)、10周（10W组）、12周（12W组）每次处死4只大鼠(n=4)，获取大鼠的移植肾，比较慢排组与对照组的肾脏组织病理学改变，验证慢性排斥模型是否建模成功，使用单因素方差分析比较慢性排斥组中各组的皮质纤维化比例是否存在差异，以P<0.05表示差异有统计学意义。建立大鼠肾移植急性排斥模型，随机将16只Wistar大鼠的左肾移植给16只SD大鼠（原位移植），术后将16只肾移植大鼠分成A、B两组，A组为急性排斥组，术后未予免疫抑制剂，B组为对照组，术后给予环孢素A注射液(2 mg/kg.d-l)腹腔注射。随机于肾移植术后第1天（1d组）、3天(3d组)、5天（5d组）、7天（7d组）将A和B组大鼠每次每组挑选出2只大鼠处死，取出移植肾，比较急性排斥组与对照组的肾脏组织病理学改变，验证急性排斥模型是否建模成功，并使用单因素方差分析比较急性排斥组中各组的皮质纤维化比例是否存在差异，以P＜0.05表示差异有统计学意义。建立大鼠环孢素肾病模型，25只SD大鼠予以低钠饮食饲养1周，随机选择5只大鼠处死取左肾（对照组），剩余20只大鼠予以环孢素A(30 mg/kg.d-1)腹腔内注射，并继续予以低钠饮食，按随机原则将20只大鼠分为4组，每组5只，分别在给药后1周(1w组)、2周（2W组）、4周(4W组)、6周（6W组）取大鼠左肾，比较环孢素肾病组与对照组的肾脏组织病理学改变，验证环孢素肾病模型是否建模成功，并使用单因素方差分析比较环孢素中毒组中各组的皮质纤维化比例是否存在差异，以P＜0.05表示差异有统计学意义。建立大鼠单侧输尿管梗阻模型，18只SD大鼠按随机原则分为UUO组和假手术组(sham)，每组9只，手术组结扎左侧输尿管，假手术组仅分离输尿管，不结扎。分别于建模后第3天（3d组）、7天(7d组)、14天（14d组）时取两组大鼠左侧肾脏，比较UUO组与sham组的肾脏组织病理学改变，验证UUO模型是否建模成功，并使用用单因素方差分析比较UUO模型中各组的皮质纤维化比例是否存在差异，以P＜0.05表示差异有统计学意义。通过SHG/TPEF扫描4种模型各时段的肾脏标本，动态观察不同病因引起的肾脏胶原纤维的类型、发生、发展过程及形态、分布特点。
　　结果:传统病理证实4种不同病因的大鼠肾纤维化模型建模成功，单因素方差分析显示慢性排斥组（F=104.53，P=0.000）、环孢素肾病组(F=76.191，P=0.000)、UUO组(F=27.23，P=0.001)中各时间段的皮质纤维化比例有统计学差异，而急性排斥组中各时段的皮质纤维化比例差异无统计学意义(F=4.722，P=0.084)。UUO模型的肾脏纤维化进展最为迅速，术后第7天肾间质即可观察到胶原纤维广泛形成，而术后第14天可以观察到移植肾间质重度纤维化。肾移植急性排斥模型，肾间质未出现进展性纤维化。移植肾慢性排斥模型建模周期长，纤维化进展较慢。而低钠饮食大鼠的环孢素A肾病模型在6周内即可观察到肾间质中大量胶原分布。使用SHG/TPEF和传统病理技术对4种模型肾脏进行观察发现，Masson染色图片中鲍曼氏囊囊壁及肾小球基底膜有蓝染的胶原纤维，但在SHG/TPEF图像中，鲍曼氏囊囊壁及肾小球基底膜未见绿色的胶原信号。胶原纤维大部分沉积在皮质区的肾间质中以及皮髓交界处，在髓质区基本无胶原纤维分布;肾脏中胶原纤维的形成、发展、沉积在3种不同病因的肾脏模型中过程类似，仅纤维形成的时间进程根据病因的不同有快慢。
　　结论:4种大鼠肾纤维化模型建模成功，大鼠UUO、CsA中毒、慢排模型肾间质纤维化明显，急排模型肾纤维化不明显。SHG/TPEF显微成像可特异性显示肾脏中Ⅰ型胶原，不能显示Ⅳ胶原;不同病因的模型纤维沉积的进程有快慢不同。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 非线性光学技术诊断人移植肾纤维化的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第二章 4种大鼠肾脏纤维化模型的建立以及用SHG／TPEF观察大鼠肾脏胶原纤维的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文小结

综述 肾间质纤维化定量及半定量分析方法的研究进展

英汉缩略语名词对照表

攻读学位期间成果

致谢

声明

统计学审稿证明