新型可降解镁钙锶合金体外生物学性能的研究

摘要

背景：
　　近年来，随着交通行业、运输行业、建筑行业等行业快速发展和我国全民老龄化的到来，骨折的发病率也日益增多，因而导致骨折后需要植入钢板等内固定的患者也越来越多。目前临床常用的钛合金、不锈钢、钴铬合金等永久性骨植入材料，但这些植入材料具有容易造成应力遮挡、延缓骨折的愈合、治愈后需二次手术、磨屑和毒性金属阳离子引发炎性反应等缺点。
　　基于北京大学材料学院郑玉峰教授前期大量的体内、体外研究数据表明，镁钙合金(Mg-1.0wt％ Ca alloy)具有良好的生物相容性和良好的抗腐蚀性能，是较为理想的镁合金材料，但其动物实验表明，由于其降解速率仍然较快，无法维持足够时长的机械强度，因而如何让植入材料的降解速度和骨折治愈速度/骨组织重建速度匹配，是当前需着重解决的问题。锶元素是人体必需的、无毒性的微量元素之一，可促进成骨细胞增殖、分化和抑制破骨细胞活性，另有研究表明Sr可以明显改善镁的晶粒大小从而提高其耐腐蚀性能。因而我们提出将微量的锶元素添加到镁钙合金材料中，希望即可提高其耐腐蚀性能及机械强度，又具有明显促进成骨细胞分化的作用，因而设计出四种新型的Mg-1Ca-x wt.％ Sr合金材料，但要作为一种新型的医用可降解金属材料，其具体的生物学性能如何尚不清楚。
　　目的：
　　体外条件下观察四种镁合金材料对细胞生长、增殖、成骨矿化及溶血的影响，初步评价材料的生物相容性及生物活性，验证其作为一种新型医用可降解金属材料的安全性及有效性，为后期动物实验及临床应用提供依据;随后进一步探讨镁钙锶合金介导成骨分化的信号通路。
　　方法：
　　1.材料的表征:通过ICP-AES分析材料的化学组成，通过光镜及扫描电镜观察材料的表面形貌，并用能谱分析仪及X线衍射仪检测材料晶界的组成及化学成分，通过pHS-2C数字式酸度计测定浸提液的pH值，通过蛋白早期粘附实验研究材料对蛋白的吸附能力。
　　2.生物相容性试验:按照IS010993-12标准（试样表面积/浸体介质=1.25cm2/ml）分别制备各种材料浸提液并培养细胞，空白对照组采用含10％FBS的α-MEM培养基培养。采用细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量判断有无细胞毒性，倒置显微镜观察各种浸提液培养的细胞形态，MTT法检测四种材料对细胞相对增殖率的影响，溶血试验判断四种材料对血液红细胞的有无溶血反应，根据上述结果从而综合评价四种镁合金材料的生物安全性。
　　3.成骨矿化:采用对硝基苯磷酸酯法(p-NPP)检测细胞内总蛋白及ALP活性，茜素红染色法观察矿化结节形成并进行定量分析，天狼星红染色观察胶原的分泌并进行定量分析，进一步采用RT-PCR技术检测细胞内成骨相关基因的表达。
　　4.成骨信号通路:通过Western Blotting检测细胞成骨分化MAPK信号通路中p-ERK1/2、p-JNK、p-P38蛋白的表达。
　　结果：
　　1.1 材料的表征
　　1.1.1 通过ICP-AES分析得出四种材料的成分和元素含量基本为Mg-1.0wt％-xwt.％Sr(x=0.2，0.5，1.0，2.0)四种合金材料，与我们理想设计时的基本一致。
　　1.1.2 光镜下金相图可见四种材料随着锶含量的增加，随着合金中Sr元素含量的不断增加，合金的晶粒不断细化，材料中晶粒更加均匀细致。
　　1.1.3 电子扫描电镜合金中Sr元素含量的不断增加，合金的晶粒不断细化，合金的晶界不断从断续状向连续的网状变化，且合金的晶界同时会发生粗化形成片状化现象。能谱分析仪可见镁钙锶合金的晶界内由大量的Ca和Sr组成，说明钙锶主要以以第二相的形式存在于晶界内。
　　1.1.4 XRD分析仪得出四种镁合金主要由α-Mg，Mg2Ca和Mg17Sr2。随着Sr含量的增加，第二相中Mg17Sr2的含量也随之增多。
　　1.1.5 PH分析仪检测其浸提液的PH值可知，四种材料随着浸泡时间的延长，其PH值均成上升趋势，但所有的值均在8-11之间。
　　1.1.6 蛋白粘附试验观察发现四种材料表面对蛋白的粘附无明显差异(p＞0.05)。
　　1.2 材料的生物相容性
　　1.2.1 四种材料浸提液试样与MC3T3-E1细胞复合培养4h后，各种材料的LDH活性与空白对照组分别为(906.9±105.1) U/L，(956.7±156.2) U/L，(906.0±123.9)U/L，(925.8±40.5)U/L和(967.0±106.9) U/L，五组数据之间无明显差异(P＞0.05)，说明四种材料均无细胞毒性。
　　1.2.2 四种材料浸提液试样与MC3T3-E1细胞复合培养72h后，倒置荧光显微镜下观察四种材料浸提液培养的细胞贴壁良好，呈正常生长，形态呈梭形，胞浆内可见少量离散的黑色颗粒，未见明显细胞溶解等，符合0级标准。
　　1.2.3 细胞增殖活力检测提示，随着培养时间的延长，各组OD值逐渐升高具有统计学意义(P＜0.05)，不同时间点组内差异未见明显统计学意义(P＞0.05)，不同的时间点各组与空白对照组也未见明显统计学差异(P＞0.05);
　　1.2.4 根据四种材料浸提液与细胞共培养1，4，7d后计算其相对增值率显示，Mg-1Ca-0.2Sr合金，Mg-1Ca-0.5Sr合金，Mg-1Ca-1.0Sr合金，Mg-1Ca-2.0Sr合金在第一天的细胞增值率为93.2％，88.3％，104.2％，94.6％。Mg-1Ca-0.2Sr合金，Mg-1Ca-0.5Sr合金，Mg-1Ca-1.0Sr合金，Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的细胞增值率为88.9％，82.1％，89.1％，101.5％。Mg-1Ca-0.2Sr合金，Mg-1Ca-0.5Sr合金，Mg-1Ca-1.0Sr合金，Mg-1Ca-2.0Sr合金在第四天的细胞增值率为91.8％，98.3％，93.7％，104.5％％。四种材料的毒性评价为0级或1级，是合格的生物材料。
　　1.2.5 溶血实验结果表明Mg-1.0wt％-x wt.％Sr(x=0.2，0.5，1.0，2.0)合金材料的溶血率依次为(％):0.21，1.48，1.05，2.01，四种材料的溶血率均符合国家标准(＜5％)。
　　1.3 成骨分化
　　1.3.1 四种材料组和空白组的胞内蛋白总量无明显差异，ALP活性检测结果显示，Mg-1.0Ca-0.5Sr、Mg-1.0Ca-1.0Sr、Mg-1.0Ca-2.0Sr三组合金OD值高于空白对照组(control group)组，且三组差异均有显著性（P＜0.05），组间比较发现Mg-1.0Ca-2.0Sr合金OD值明显高于其他三组，并有明显统计学差异(P＜0.05)。
　　1.3.2 茜素红染色结果显示:从图中可以发现Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培养的培养基内可见大量红染的矿化结节生成，矿化程度最高，与对照组及其他三组材料均有统计学意义（P＜0.05）。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促进前成骨MC3T3-E1细胞矿化。
　　1.3.3 天狼星红染色结果显示:从图中可以发现Mg-1.0Ca-2.0Sr浸提液培养的培养基内可见细胞外基质染色最为深染，胶原分泌最多，定量分析结果表明:Mg-1.0Ca-2.0Sr与对照组及其他三种材料均有统计学意义（P＜0.05）。表明Mg-1.0Ca-2.0Sr表面可促进前成骨MC3T3-E1细胞外基质的胶原分泌。
　　1.3.4 RT-PCR检测成骨相关基因表达结果显示:Mg-1.0Ca-2.0Sr合金能明显促进ALP、OCN、RUNX2、OSX、BMP-2基因的表达，同时发现Mg-1.0Ca-2.0Sr能抑制OPN基因的表达。
　　1.4 成骨分化的信号通路
　　1.4.1 通过Western Blotting法检测结果发现:ERK1/2通路在加入Mg-1.0Ca-2.0Sr合金材料浸提液后5min时开始出现磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达量的增加，至30min最为明显出现一个蛋白表达量峰值随后出现下降，而磷酸化的JNK和P38蛋白在5min，15min，30min and60min一直保持低平，表达量未见明显增多。因而初步推断镁钙锶合金促成骨分化可能通过MAPK信号通路的ERK1/2通路介导的.
　　结论：
　　1.四种镁合金材料均由α-Mg，Mg2Ca和Mg17Sr2这些化合物组成，只是随着材料中锶含量的增加，其Mg17Sr2的含量出现增加，另外随着锶含量的增加，材料表面的晶粒大小以得到明显细化;
　　2.四种材料表面早期蛋白黏附的结果无明显差异;
　　3.四种镁钙锶合金材料均可通过细胞毒性评价，表现出良好的生物相容性，均为理想的植入材料;
　　4.四种材料的溶血实验结果均低于5％，具有良好的血液相容性;
　　5.Mg-1.0Ca-2.0Sr合金较其他三种材料更能能促进细胞成骨分化、矿化、胶原分泌及成骨相关基因表达，显示出良好的骨诱导活性;
　　6.Mg-1.0Ca-2.0Sr合金可能通过MAPK信号通路中的ERK1/2通路刺激成骨细胞的成骨分化;
　　7.镁钙锶合金体内生物安全性及成骨分化等实验本课题尚未涉及，因而其能否成为一种新型可降解内植入材料有待后期实验进一步验证。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 新型镁钙锶合金材料的制备和表征研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 新型镁钙锶合金材料体外生物相容性研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三章 新型镁钙锶合金材料促成骨分化的实验研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第四章 新型镁钙锶合金材料促成骨细胞的成骨分化机制的初步探讨

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

全文总结

攻读硕士学位期间发表论文

致谢

声明