斑马鱼顺铂耳毒性模型及损伤后毛细胞再生的研究

摘要

斑马鱼(zebrafish)作为新兴脊柱模式生物，具有个体小、养殖简易、体外受精、体外发育、生殖周期短、繁殖能力强、胚胎透明、品系繁多等特点，且基因与人类基因约87％相似。斑马鱼虽无外耳和中耳，但具脊椎动物之典型内耳结构。除内耳外，斑马鱼还具有另一感觉神经器官——侧线，其由大量单个神经丘组成，每个神经丘包含一簇感觉毛细胞。尤为重要的是，斑马鱼毛细胞在损伤后具有强大再生能力。有鉴于此，国际上有研究者利用斑马鱼侧线系统研究毛细胞发育、损伤及再生;部分研究者亦采用成年斑马鱼研究内耳毛细胞损伤及再生。
　　顺铂为临床常用的抗肿瘤药物，在治疗肿瘤的同时也伴有不同程度副作用，损伤人类内耳毛细胞并导致永久性感音神经性听力损失为其严重副作用之一，但其损伤机制仍未完全明确。既往研究认为哺乳动物内耳毛细胞损伤是不可逆的，而鸟类、鱼类及两栖类等低等脊柱生物，其毛细胞损伤后却存在不同程度再生。近年有研究表明，哺乳动物前庭及内耳新生毛细胞也具微弱的再生潜能，这为人类听觉毛细胞再生点燃希望。因此，加强内耳毛细胞损伤、再生机制以及相关基因治疗研究显得尤为重要。
　　既往研究中，已有顺铂损伤哺乳动物、鸟类内耳毛细胞的研究报告，但尚无顺铂损伤成年鱼类内耳毛细胞的文献报告，本研究通过建立成年斑马鱼顺铂耳毒性模型将弥补国内外相关研究领域的空白，有助进一步揭示顺铂损伤机制。亦有研究表明顺铂损伤离体培育的小鸡毛细胞后并不存在损伤后毛细胞再生，鉴于斑马鱼模型的优势及其毛细胞强大自发再生能力，本实验以成年及幼体斑马鱼为对象研究顺铂耳毒性损伤，探讨顺铂损伤对毛细胞再生的影响，揭示顺铂损伤后成年及幼体斑马鱼毛细胞再生的异同，也为今后斑马鱼毛细胞再生相关基因研究打下一定基础。
　　目的：
　　于国内、外首次建立成年斑马鱼顺铂耳毒性损伤模型，弥补相关研究领域的空白;探讨顺铂对成年斑马鱼内耳及幼体斑马鱼侧线毛细胞的毒性损伤和顺铂损伤对毛细胞再生的影响，为揭示调控毛细胞再生相关基因打下基础。
　　方法：
　　1.顺铂损伤成年斑马鱼内耳毛细胞及损伤后毛细胞增殖检测
　　1.1 成年斑马鱼腹腔注射给药
　　取发育4～5月龄成年斑马鱼，雌雄随机，重量介于0.38～0.55g之间。随机分为顺铂组、庆大霉素组及生理盐水对照组，每组6条。顺铂组给予连续两次注射24mg/kg顺铂溶液，间隔12h;庆大霉素组首次注射与顺铂组等量生理盐水，12h后注射250mg/kg硫酸庆大霉素溶液;对照组连续两次注射与顺铂组等量生理盐水。
　　1.2 成年斑马鱼内耳毛细胞静纤毛染色
　　末次腹腔注射后第1d、10d，麻醉并处死部分顺铂组及对照组斑马鱼。断头后置于4％多聚甲醛中，4℃下固定过夜，PBS清洗，体视显微镜下解剖并分离内耳各结构（球囊斑、听壶斑及椭圆囊斑）。解剖后的内耳组织于1∶100 FITC-鬼笔环肽中避光染色1h，PBS清洗，铺片，荧光显微镜下观察、拍照。
　　1.3 成年斑马鱼内耳毛细胞增殖染色
　　末次腹腔注射后24h、48h、72h，各组均经腹腔注射15μl(5mg/ml) Brdu，恢复10h，麻醉、断头处死斑马鱼，解剖固定如上诉。分别取解剖后内耳组织在4℃下于浓度为1:100鼠单克隆抗Brdu抗体培育过夜，PBS漂洗，1∶200兔抗鼠Alexa Fluor488共轭二抗室温下处理1h，PBS漂洗，铺片，滴Dapi染液，盖片，荧光显微镜下观察、计数Brdu阳性细胞。
　　2.顺铂损伤幼体斑马鱼侧线毛细胞及地塞米松促侧线毛细胞增生的探讨取受精后5天(5dpf)斑马鱼幼鱼，随机分组，每组10-15条不等;神经丘毛细胞染色选择2μM荧光活性染液Yo-Pro-1;选择P1、P7、P8三个固定侧线神经丘行毛细胞计数。
　　2.1 顺铂损伤幼体斑马鱼侧线毛细胞
　　5dpf斑马鱼幼鱼于2μM Yo-Pro-1染色30分钟，随机分为对照组和实验组，实验组加入1nM顺铂溶液，对照组加入等量系统水，暗室内培育3h、6h。撤药后0h、3h、6h于荧光显微镜下观察拍照并计数神经丘内毛细胞。
　　2.2 地塞米松促进幼体斑马鱼侧线毛细胞增生
　　取5dpf斑马鱼幼鱼随机分为对照组和实验组，实验组加入浓度为10μM、25μM地塞米松溶液，对照组加入等量系统水，培育48h，撤药即刻行Yo-Pro-1染色，荧光显微镜下观察、计数神经丘内毛细胞。
　　3.3地塞米松对顺铂、新霉素损伤后侧线毛细胞再生的影响
　　取5dpf斑马鱼幼鱼，随机分为对照组、顺铂组、新霉素组。顺铂组加入1nM顺铂溶液处理3h，新霉素组加入200μM硫酸新霉素溶液处理1h，两组在撤药后3h均加入25μM地塞米松溶液或等量系统水，对照组加入等量系统水。于地塞米松作用后24h、48h分别行Yo-Pro-1染色，荧光显微镜下观察、计数神经丘内毛细胞。
　　4.统计学分析
　　资料分析采用SPSS17.0统计分析软件，数据以均值±标准差((x)±s)表示，两组比较采用独立样本t检验，多重比较采用单向方差分析(one-way ANOVA)，方差齐性检验采取Levene检验。设P＜0.05差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.顺铂注射对成年斑马鱼内耳毛细胞束密度的影响
　　通过FITC-鬼笔环肽染色，发现斑马鱼听觉感觉上皮球囊、椭圆囊、听壶具有各自不同的形态;在末次顺铂注射后第1天，选取球囊斑喙端至尾端轴线上面积为1600μm2的四个固定区域(5％，25％，50％，75％)行毛细胞束计数，得出四个区域毛细胞束均数分别为:36.25±2.82、19.75±2.12、16.50±1.93、19.62±2.33(N=7-9)，经统计同一部位顺铂组毛细胞束均少于对照组（P＜0.05）。在末次顺铂注射后第10天，计数得出球囊斑四个区域的毛细胞束均数分别为:38.83±2.32、25.14±2.41、19.86±1.77,26.71±2.50(N=6-7)，经统计25％区域毛细胞束少于对照组（P＜0.05），其余各区域毛细胞束与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05)。
　　2.顺铂损伤后成年斑马鱼内耳毛细胞的增殖检测
　　通过Brdu染色发现正常成年斑马鱼内耳感觉上皮内存在零散的增殖细胞。选取球囊斑行增殖细胞计数，得出在连续腹腔注射24mg/kg顺铂溶液后24h、48h，每块球囊斑内增殖细胞数分别为:7.29±1.50、10.71±2.21(N=7)，明显少于对照组（P＜0.05）及庆大霉素组（P＜0.001），而连续顺铂注射后72h，每块球囊斑内增殖细胞数为:25.71±3.45(N=7)，明显多于同期对照组（P＜0.001）;在硫酸庆大霉素注射后24h、48h、72h均可检测到大量增殖细胞，但随着时间的推移增殖细胞数量逐渐减少，经统计三个时间段球囊斑内增殖细胞数均多于同期生理盐水对照组(P＜0.005)。
　　3.顺铂损伤幼体斑马鱼侧线毛细胞
　　1nM顺铂处理6h组在撤药后0h、3h计数P1、P7、P8三个神经丘得出毛细胞均数为:1.970±0.526(N=11)，1.767±0.629(N=10);而1nM顺铂处理3h组在撤药后0h、3h、6h计数得到毛细胞均数为:5.909±0.761(N=11)，2.633±0.483(N=10)，2.528±0.643(N=12)。经统计各顺铂处理组的侧线毛细胞数量均少于正常对照组（P＜0.05）。
　　4.地塞米松促进正常幼体斑马鱼侧线毛细胞的增生
　　10μM、25μM地塞米松溶液处理5dpf斑马鱼48h，在撤药后计数毛细胞的数量分别为:11.028±1.314(N=12)，11.364±1.545(N=11);同一部位7dpf对照组毛细胞计数为:9.922±0.862(N=13)。经统计10μM、25μM地塞米松组与7dpf对照组相比神经丘毛细胞数量的差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　5.地塞米松促进新霉素而非顺铂损伤后幼体斑马鱼侧线毛细胞的增生
　　通过计数侧线神经丘毛细胞，经单向方差分析统计结果:新霉素+地塞米松24h组vs新霉素24h组，P=0.178，二者差异无统计学意义;新霉素+地塞米松48h组vs新霉素48h组，P=0.001，二者差异有统计学意义。在25μM地塞米松处理后24h、48h，顺铂+地塞米松组与损伤对照组相比，两组毛细胞数量无统计学差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.经腹腔连续两次注射24mg/kg顺铂溶液（间隔12小时）可损伤成年斑马鱼内耳毛细胞;正常情况下，成年斑马鱼内耳毛细胞存在自发更新现象;在耳毒性药物庆大霉素损伤后可迅速启动毛细胞再生，相对于庆大霉素损伤，顺铂损伤可延缓成年斑马鱼内耳毛细胞的再生进程。
　　2.1 nM顺铂浸泡给药可快速损伤幼体斑马鱼侧线毛细胞，且顺铂损伤存在时间依赖性;新霉素损伤后侧线毛细胞可快速再生，而顺铂损伤后侧线毛细胞的再生速度相对缓慢。
　　3.地塞米松可促进正常及新霉素损伤后幼体斑马鱼侧线毛细胞的增生，但并不能有效促进顺铂损伤后侧线毛细胞的再生。

目录

摘要

前言

第一章 成年斑马鱼顺铂耳毒性模型的建立及顺铂损伤后毛细胞再生研究

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 结论

5 讨论

第二章 顺铂损伤幼体斑马鱼侧线毛细胞及地塞米松促进侧线毛细胞再生的探讨

引言

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 结论

5 讨论

全文总结

参考文献

综述 斑马鱼脊柱模式生物在内耳科学领域的研究进展

中英文缩略词表

硕士期间成果

致谢

声明