IL-1β对外周神经系统华勒变性中施旺细胞的影响

摘要

研究目的:
　　通过改进后的大鼠坐骨神经体外华勒氏变性模型，进一步确认该模型的可靠性，并以该模型为基础，研究外周神经系统华勒变性早期施旺细胞IL-1β的表达情况，以及IL-1β对施旺细胞去分化、增殖及凋亡影响，并研究探讨相关的作用机制，希望以此为窗口来探寻局部组织损伤后炎症因子对成体细胞去分化及组织再生的影响。
　　研究方法:
　　1.体外华勒氏变性模型的制备及分组干预.
　　2.Real time PCR测定体外华勒氏变性模型中不同时间点(6H、12H、24 H)施旺细胞IL-1β mRNA表达量。
　　3.Elisa测定体外华勒氏变性模型中不同时间点(12H、24 H、36H、48H)施旺细胞IL-1β蛋白的表达量。
　　4.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预（0 ng/ml、5 ng/ml和50 ng/ml）48小时后，免疫荧光染色标记施旺细胞去分化指标p75NTR和分化指标MPZ，并且Western Blot分别检测并量化比较p75NTR和MPZ蛋白表达量。
　　5.体外华勒氏变性模型中0 ng/ml（对照组）或5 ng/ml IL-1β干预后，Realtime PCR检测不同时间点(6H、12H、24 H)去分化指标p75NTR和分化指标MPZ mRNA表达量。
　　6.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预（0 ng/ml和5 ng/ml）24小时，免疫荧光染色标记施旺细胞转录因子c-Jun，并统计比较c-Jun阳性率;WesternBlot检测进一步量化比较转录因子c-Jun表达量差异。
　　7.体外华勒氏变性模型中0 ng/ml（对照组）或5 ng/ml IL-1β干预后，Realtime PCR检测不同时间点(6H、12H、24 H)转录因子c-Jun mRNA表达量。
　　8.体外华勒氏变性模型中0 ng/ml（对照组）或5 ng/ml IL-1β干预后，AP-1activity assay检测不同时间点(6H、12H、24 H)核转录激活蛋白1(AP-1)的活性相对值。
　　9.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预（0 ng/ml和5 ng/ml）48小时，免疫荧光染色标记施旺细胞增殖标记Ki67，并统计比较Ki67阳性率（即细胞增殖率）。
　　10.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预（0 ng/ml和5 ng/ml）48小时，Tunel法染色标记施旺细胞细胞凋亡情况，并统计各组Tunel阳性率（即细胞凋亡率）。
　　11.体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预（0 ng/ml和5 ng/ml）24小时，Western Blot检测细胞凋亡促进蛋白Bax和细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达量，统计比较Bcl-2和Bax表达量以及Bcl-2/Bax比值。
　　12.数据处理及统计学分析方法.
　　研究结果：
　　1.体外华勒氏变性模型中施旺细胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白表达量变化
　　大鼠坐骨神经受损离体后华勒氏变性过程中施旺细胞IL-1βmRNA和IL-1β蛋白表达量逐渐增高，IL-1βmRNA于12小时较对照组升高了近7倍达到高峰期，随后开始有所降低;IL-1β蛋白分泌量逐渐增高，于36小时较对照组升高了近4倍达到高峰期，随后开始有所降低。
　　2.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中p75NTR和MPZ表达情况
　　LSD法检验不同浓度组与对照组0 ng/ml之间的表达差异），5 ng/ml浓度组较对照组0 ng/ml中p75NTR表达量显著升高(p=0.008)，MPZ表达量显著降低(p=0.005);50ng/ml浓度组较对照组0 ng/ml中p75NTR以及MPZ表达量差别无统计学意义。Western Blot检测与免疫荧光染色结果一致。
　　3.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中p75NTR和MPZ mRNA表达情况
　　Real time PCR检测结果显示，IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中施旺细胞p75NTR mRNA表达量显著升高，而MPZ mRNA表达量显著降低。
　　4.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中转录因子c-Jun表达情况
　　适当浓度（5 ng/ml）IL-1β可促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞细胞核内转录因子c-Jun表达。
　　5.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中c-Jun mRNA表达情况
　　适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞细胞核内转录因子c-Jun表达。
　　6.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中AP-1的活性变化情况
　　适当浓度(5 ng/ml) IL-1β不仅促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞细胞核内转录因子c-Jun表达，而且增加华勒氏变性过程中施旺细胞AP-1的活性。
　　7.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中细胞增殖标记Ki67表达情况
　　给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)48小时，免疫荧光染色标记施旺细胞增殖标记Ki67，观察可见Ki67均主要位于细胞核内，且5 ng/ml干预组Ki67表达量较0 ng/ml组有所升高;量化比较两组之间施旺细胞的细胞核内Ki67阳性率，5 ng/ml干预组Ki67阳性率较0 ng/ml组显著升高(t=-6.264，p=0.003)。免疫荧光染色显示，适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可促进坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞的增殖。
　　8.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中细胞凋亡情况
　　给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)48小时，Tunel法染色标记施旺细胞细胞凋亡情况，并统计各组Tunel阳性率（即细胞凋亡率）的差异，显示5 ng/ml干预组凋亡率较0 ng/ml组显著降低(t=4.274，p=0.013)。Tunel法细胞凋亡检测显示，适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可抑制坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞的凋亡。
　　9.IL-1β干预后体外华勒氏变性模型中Bax和Bcl-2表达情况
　　给于体外华勒氏变性模型不同浓度IL-1β干预(0 ng/ml和5 ng/ml)24小时，Western Blot检测细胞凋亡促进蛋白Bax和细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2蛋白表达量，显示5 ng/ml浓度组较对照组0 ng/ml中施旺细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2表达量显著升高（t=-3.456，p=0.026），凋亡促进蛋白Bax表达量显著降低(t=3.052，p=0.038)，且Bcl-2/Bax蛋白表达量比例显著升高(t=-4.397，p=0.012)。这与Tunel法凋亡细胞染色结果一致。可见，适当浓度(5 ng/ml) IL-1β可增加凋亡抑制蛋白Bcl-2表达量，降低凋亡促进蛋白Bax表达量，从而抑制坐骨神经华勒氏变性过程中施旺细胞凋亡。
　　研究结论：
　　本实验研究显示，体外华勒氏变性模型是研究周围神经系统华勒氏变性过程中干预施旺细胞去分化影响因素的有效模型。通过该模型，我们研究进一步证实华勒氏变性早期施旺细胞IL-1β mRNA表达量升高，IL-1β蛋白分泌量增多，华勒氏变性可视为外周神经系统应对神经损伤的固有免疫反应。通过该模型给予相应干预，我们研究发现适当浓度的IL-1β具有促进华勒氏变性过程中施旺细胞去分化的作用，以及促进华勒氏变性过程中施旺细胞清除髓鞘碎片，从而促进周围神经再生，而过高浓度的IL-1β对华勒氏变性过程中施旺细胞去分化以及髓鞘碎片的清除并无促进作用。
　　本研究证实华勒氏变性早期适当浓度的IL-1β具有促进施旺细胞转录因子c-Jun mRNA表达量，以及促进施旺细胞的细胞核内转录因子c-Jun的高表达，并促进施旺细胞内AP-1活化;并认为华勒氏变性早期IL-1β通过c-Jun/AP-1通路促进施旺细胞去分化，以及促进施旺细胞清除髓鞘碎片，从而促进周围神经再生。
　　本研究证实华勒氏变性早期适当浓度的IL-1β具有促进施旺细胞增殖，以及增加Bcl-2表达量，减低Bax表达量，升高Bcl-2/Bax比值，抑制施旺细胞凋亡的积极作用;并认为IL-1β通过促进c-Jun/AP-1通路活化促进施旺细胞增殖，通过Bcl-2/Bax通路抑制施旺细胞凋亡。

目录

摘要

第一章 外周神经系统华勒变性中IL-1β对施旺细胞去分化的影响

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

第二章 外周神经系统华勒变性中IL-1β促进施旺细胞去分化的作用机制研究

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4 结论

参考文献

第三章 外周神经系统华勒变性中IL-1β对施旺细胞增殖及凋亡的影响

前言

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

4．结论

参考文献

附录

成果

统计学审稿证明

致谢

声明