基于单细胞层层组装技术构建三维多细胞肿瘤球体模型

摘要

上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition，EMT)是指本身具有极性的上皮细胞在某些因素的刺激下，上皮特性减少、间质特性增多、细胞基质粘附消失和细胞骨架重塑，从而导致上皮细胞极性消失，细胞运动能力增加，获得浸润性和迁移能力。在上皮来源的恶性肿瘤中，EMT是肿瘤细胞获得浸润和迁移能力的重要途径。尽管EMT的发生同肿瘤微环境密切相关，但肿瘤微环境诱导肿瘤细胞发生EMT的确切机制仍不清楚。本研究在已构建的三维肿瘤模型的平台上比较研究二维培养体系与三维培养体系中乳腺癌细胞EMT相关蛋白的表达差异，如CD47、N-Cadherin等。在体外三维培养体系下模拟体内乳腺癌N-Cadherin表达增多触发EMT促进肿瘤细胞浸润和迁移的临床特点，对我们构建的三维肿瘤模型进行验证。
　　目的:
　　1.构建用于基础研究以及药物筛选的体外组织工程化肿瘤三维模型，并对该模型的形貌、表面电荷、生物相容性等性质进行研究:
　　2.体外所构建的三维人源性乳腺癌肿瘤模型的体外验证。
　　方法:
　　1.细胞培养
　　购入人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，复苏后传代，将其培养在含有10％胎牛血清，0.1％青霉素和链霉素的RPMI1640培养基中，于37℃，含5％CO2的培养箱中常规培养。每天换液，待细胞融合率达80％时，用含0.02％ EDTA的0.25％的胰蛋白酶液消化并传代。待细胞量足够，取足量细胞用于层层组装。
　　2.对单个细胞进行（明胶-海藻酸钠）3-壳聚糖的层层组装及多细胞肿瘤球体的形成
　　设计合成与细胞相容性良好的纳米级细胞外基质成分，以促进细胞与细胞之间，细胞与细胞微环境之间的相互作用。该纳米级细胞外基质成分包括A型明胶、海藻酸钠，需分别带有正电荷和负电荷，因此细胞外基质成分依次层层包裹于细胞表面。细胞经胰酶消化后，计数1×107，于离心机中，1000rpm/min，离心5min，弃去上清液，用7ml0.1％(w/v)明胶溶液轻轻重悬收集的细胞后，常温放置10min;接着于离心机中，1000rpm/min，离心5min，弃去明胶溶液，此时明胶层粘附于单个细胞表面。然后，用7ml预热的0.1％(w/v)海藻酸钠溶液轻轻重悬包裹有明胶层的细胞团，则带有阴离子的聚合电解质层粘附于明胶层上，常温孵育10min后，离心弃去海藻酸钠溶液:接着将等体积的A型明胶溶液（阳离子聚合电解质溶液）加入包裹有明胶和海藻酸钠的细胞团。此过程通过依次在细胞表面包裹带有相反电荷的聚合电解质三个循环。最后，用7ml预热的0.2％(w/v) PH6.7的中分子量壳聚糖溶液（阳离子聚合电解质）使最外层均粘附有阴离子聚合电解质（海藻酸钠）的单个肿瘤细胞之间发生聚合反应，数分钟后，1000rpm/min，离心10min，多细胞肿瘤球形成，弃去壳聚糖溶液，用预热的含10％ FBS的RPMI1640培养基轻轻重悬，然后将多细胞肿瘤球转移至一个新的六孔板中，加入RPMI1640培养基，置于5％ CO2，37℃培养箱中培养，培养基每天更换。
　　3.组织工程化人源性乳腺癌三维模型的表征及生物相容性研究
　　组织工程化人源性乳腺癌三维模型构建成功后，一般情况下，需要对其表面形貌、所带电荷、生物相容性等性质进行研究。本实验中分别采用光学显微镜、激光粒度分析仪、扫描电镜、荧光显微镜、活死染色等仪器和技术对其性质进行测量和分析。
　　4.体外所构建三维人源性乳腺癌肿瘤模型的体外验证
　　实验分为三组，3Di，3Dm和2D，称肿瘤球中的细胞为3Dis;肿瘤球培养过程中，观察发现其培养皿底板有细胞迁移出来并贴壁生长，称迁移出来的细胞为3Dms;称二维培养的细胞为2D。分别培养四天后，提取总蛋白，Westernblotting检测p-ERK，ERK，CD47蛋白的表达:取出多细胞肿瘤球，PBS洗三次，4％多聚甲醛固定24小时，30％蔗糖溶液固定1周后，冰冻切片，放于37℃干燥箱中烤24小时，免疫荧光检测E-Cadherin，N-Cadherin蛋白的表达。
　　5.统计学分析
　　以上实验均设有阴性对照实验，每次实验至少重复3次。统计分析采用SPSS13.0统计软件完成，结果用均数±标准差（Mean±SD）来表示。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐性的组间比较采用Tukey法，方差不齐的组间比较采用Dunnett's T3法，p＜0.05认为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.成功构建体外组织工程化人源性乳腺癌三维模型。通过A型明胶与海藻酸钠静电作用层层包裹于细胞三个循环，得到单个肿瘤细胞层层组装的模型:然后加入中分子量壳聚糖溶液，使层层组装的单个细胞间发生聚合，形成多细胞肿瘤球，即组织工程化人源性乳腺癌肿瘤模型。
　　2.光学显微镜下显示人源性乳腺癌三维模型呈团块状，内部细胞(3Dis)形态规则，呈圆形，轮廓清晰，连接紧密:随着细胞培养时间的延长，一些肿瘤细胞从肿瘤球体迁出，迁移出的肿瘤细胞(3Dms)形态规则，轮廓清晰，贴壁生长，状态良好。
　　3.用FITC标记明胶，在荧光显微镜下单纯（明胶-海藻酸钠）3层层组装组以及（明胶-海藻酸钠）3层层组装后用壳聚糖聚合组均显示:每个细胞周围均有一层绿色荧光。这说明层层组装的纳米膜成功包裹于单个细胞。
　　4.激光粒度分析仪测试结果显示，细胞表面电荷随着带相反电荷聚合电解质的轮流加入，呈现曲折变化，表明细胞表面层层组装上了纳米材料。
　　5.扫描电镜观察3D体外肿瘤模型的形态显示:多细胞肿瘤球具有三维立体结构，细胞生长良好，细胞表面成功包裹了纳米材料，保持了细胞外基质的完整性:细胞与细胞之间并非紧密连接，有较大孔隙，有利于水分，营养物质及氧气渗透，形成适于肿瘤细胞生长的三维立体环境。
　　6.对多细胞肿瘤球进行活死染色，荧光显微镜下观察示，整个肿瘤球呈绿色（活细胞），几乎没有红色（死细胞）出现。证明纳米材料生物相容性良好，成功构建了便于基础研究以及药物筛选的三维人源性乳腺癌模型。
　　7.Western blotting和免疫荧光验证了此基于单个细胞层层组装构建的三维多细胞肿瘤球体模型内的微环境可通过N-Cadherin的过表达来触发EMT。Western blotting结果显示3Dm和2D组p-ERK和ERK的表达均明显高于3Di组:而3Di组CD47表达明显高于3Dm和2D组。免疫荧光结果显示2D组呈现E-Cadherin过表达，但无N-Cadherin表达;而3Di组呈现高表达的E-Cadherin和N-Cadherin;3Dm组则呈现E-Cadherin高表达，N-Cadherin低表达。
　　结论:
　　在本研究中，我们用超薄基质材料层层包裹单个肿瘤细胞的方法构建了一个三维多细胞肿瘤球体模型来模拟在体实体瘤的微环境，并对该模型的形貌及表面电荷进行一系列表征，通过活死染色验证了模型中细胞的活力。还在该三维模型的平台上进一步比较研究了二维培养体系与三维培养体系中乳腺癌细胞EMT相关蛋白的表达差异，并且该模型在体外三维培养体系下很好地模拟了体内乳腺癌N-Cadherin表达增多触发EMT促进肿瘤细胞浸润和迁移的临床特点，对我们构建的三维肿瘤模型进行验证。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 三维多细胞肿瘤球体模型的构建及其表征

引言

1．实验设备与材料

2．实验方法和步骤

3．实验结果与讨论

4．结论

参考文献

第二章 三维多细胞肿瘤球体模型的体外验证

引言

1．实验材料与设备

2．实验方法与步骤

3．实验结果与讨论

4．结论

参考文献

全文小结

中英文对照缩略词表

攻读硕士学位期间成果

致谢

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