脚桥核低频电刺激影响6-OHDA帕金森大鼠的步态和丘脑腹外侧核神经递质水平

摘要

背景:
　　帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常见的中枢神经系统的渐进性神经退行性疾病。该病以中脑黑质多巴胺神经元变性为主要病理特征，常发病于中老年人。统计学显示，在65岁以上老年人中，PD发病率大于1％，严重影响老年人的生活。临床上PD主要表现为肢体静止性震颤、僵直、运动迟缓等运动功能失调，在疾病晚期还将出现步态困难和姿势不稳(postural instability andgait difficulty，PIGD)等轴性症状。该症状常常是使患者致残的主要原因。
　　临床上，治疗帕金森病的主要方法有内科药物和外科手术治疗。其中外科手术治疗是在左旋多巴(levodapa，L-dopa)应用之前发展起来，并且近年来再次兴起的治疗药物难治性晚期PD患者运动并发症的手段。早期的手术方式主要是立体定向损毁中枢核团，主要在苍白球内侧部(globus pallidus internus，GPi)、丘脑(丘脑腹部中间核，ventral intermediate nucleus，Vim)和丘脑底核(subthalamicnucleus，STN)。之后，立体定向脑深部电刺激术（deep brain stimulation，DBS）成为对损毁术的一种可调控和可逆的替代手段。该手术通过立体定向将刺激电极植入特定的深部脑神经核团，对核团进行刺激，调节引起症状的异常电活动，从而改善患者的症状。目前DBS已成为治疗晚期PD患者最佳的外科方法，尤其对药物难治性PD能取得显著的临床治疗效果。
　　尽管Vim-DBS可有效改善PD患者的震颤;GPi-DBS可有效改善PD患者对侧肢体的震颤、强直、运动迟缓;STN对肌强直、运动迟缓、震颤均有效，但是以上治疗方式对晚期PIGD疗效欠佳。近来研究发现，PIGD和脚桥核(pedunculopontine nucleus，PPN)功能失调有关，目前PPN已被推荐为治疗PIGD的潜在目标核团。然而对于低频刺激PPN对PD大鼠步态方面的作用的报道甚少。
　　CatWalk是一种自动步态检测系统，能够客观量化自发运动期间动物的动、静态步态参数。CatWalk方法已被用于评估了一系列动物模型的步态参数，如疼痛和脊柱损伤模型。
　　尽管研究者对PPN的兴趣正在逐步增加，PPN-DBS治疗PIGD的作用机制目前是不清楚的。实际上我们认为探索PPN-DBS对PD状态下运动丘脑(大鼠主要包括ventrolateral and Ventroanterior thalamus nuclei，VA/VL)神经递质水平的影响，对近一步理解其治疗轴性症状的机制可能是重要的。理由如下:
　　1.PPN主要由胆碱能、谷氨酸和氨基丁酸能神经元组成。PD病人和PD动物模型PPN存在胆碱能神经元丢失。且胆碱能丢失被认为与PD的PIGD相关。
　　2.基底前脑主要有胆碱能神经元组成，接受PPN的胆碱能投射，也存在变性。
　　3.PPN和基底前脑均发送胆碱能纤维到运动丘脑。
　　4.运动丘脑与大脑皮层多个区域存在纤维联系，在整合基底节、小脑和皮层运动相关信息方面发挥着重要作用。
　　5.蓝斑主要有去甲肾上腺素能神经元组成，PD病人和动物模型存在蓝斑变性。
　　基于上面所述，首先，评估PPN-DBS能否在PD动物模型上（如6-hydroxydopamine（6-OHDA）-PD大鼠）改善步态，有助于我们进一步理解PPN-DBS的行为学作用。其次，与PIGD相关的几个脑组织结构均与运动丘脑存在联系，而运动丘脑被认为参与运动相关信息的整合。它的异常状态可能涉及到PIGD。因此研究PPN-DBS与运动丘脑内相关神经递质水平的关系，可能对理解PPN-DBS改善PIGD的作用机制是至关重要的。
　　目的:
　　通过CatWalk步态分析系统评估偏侧6-OHDA-PD大鼠的步态,并分析低频刺激PPN对PD大鼠步态的影响，从而进一步理解PPN-DBS在PD啮齿动物模型上的行为学作用;探索PPN-DBS对偏侧6-OHDA-PD大鼠运动丘脑（本实验位于VL亚区）神经递质水平的影响，以加深理解PPN-DBS改善PIGD的潜在机制。当前实验主要探索VL内谷氨酸（glutamic acid，Glu），γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，γ-GABA)，乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)和去甲肾上腺素(noradrenalin，NA)水平。
　　方法:
　　1.实验分组
　　SPF级成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠38只(重280-320g)，随机分为三组。A组，假损毁组(n=10)，右侧前脑内侧纵束(medial forcbrain bundle，MFB)立体定向注射4μl生理盐水;B组，损毁组(n=14)，右侧MFB注射4μl（3μg/μl）6-OHDA;C组，损毁+电极组(n=14)，右侧MFB注射4μl（3μg/μl）6-OHDA，并且在右侧PPN植入微电极。所有大鼠在VL区域接受微透析探针导管植入。
　　2.使用CatWalk采集大鼠步态参数基线值:
　　在立体定向手术前，所有大鼠进行Catwalk适应性训练1周。训练方法:将大鼠置入Catwalk通道，训练其自发连续不停顿地通过通道，每只大鼠早晚各训练一次，每次来回跑过通道至少5次，达到训练合格的大鼠给予食物奖赏，整个训练在安静暗室中完成。训练合格标准为:大鼠需连续不停顿地通过通道，次数至少5次。训练结束后，在接下来的两天，采集所有大鼠Catwalk步态数据作为基线值。
　　3.立体定向手术
　　手术1，A组，即假手术组的大鼠麻醉后固定在立体定向仪上，齿杆低于耳杆3.4mm，根据Paxinos and Watson的《大鼠脑立体定向图谱》确定右侧前脑内侧纵束(MFB)坐标:前囟后2.0mm，旁开2.0mm，硬膜下8.0mm。在预定坐标位置缓慢注射4ul含0.02％抗坏血酸的生理盐水。B组和C组大鼠注射12ug/4ul的6-OHDA溶液（用含有0.02％抗坏血酸的生理盐水溶解）。
　　手术2，两周后，B组和C组大鼠再次麻醉，头部固定于立体定向仪，齿杆低于耳杆3.4mm，确定VL坐标:前囟后2.28mm，旁开2.4mm，硬膜下5.4mm。在坐标点植入微透析导管。同时确定PPN坐标:前囟后7.9mm，旁开2.1mm，硬膜下7.0mm。C组大鼠然后按坐标缓慢植入微电极。大鼠术后进行1周恢复。
　　4.采集步态参数
　　在采集前，按照上述方法再次用CatWalk训练大鼠5天，加强记忆。随后两天，采集所有大鼠步态，4次/天，每只大鼠每次通过跑道不少于5次。C组的大鼠在跑前15分钟进行电刺激，随后5分钟放入跑道测试，同时进行电刺激。
　　5.电刺激程序
　　测试每只大鼠的刺激阈值。方法:调到频率25Hz，脉宽80us，然后从20μA电流开始，逐步调高电流，每次5μA，进行刺激，观察大鼠的反应，若出现大鼠身体扭转至一侧或者头部抖动，此时的电流强度确定为该大鼠的阈值。正式刺激时采用低于阈值20μA的电流，25Hz频率和80μs脉宽刺激。在装电极的大鼠，分别测试通电刺激和未通电状态的步态。
　　6.微透析程序
　　探针的激活:
　　(1)将探针固定于支架上，用人工脑脊液灌注各部分以排空气泡。在连接探针时，探针出口端所接的管不应太长(约5cm)，否则压力大使薄膜胀气。
　　(2)首次使用时将探针、连接管和适配器浸泡于70％酒精中5-10min，并以1ul/min速度灌注70％酒精至少1h，流速不可大于10μl/min。以人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)取代70％酒精以1μl/min速度至少灌注1h。
　　样品收集:
　　每30min收集一次样本，弃去前面2小时的样本，然后收集两个基线样本，(C组刺激20min)之后再收集6个样本。样品收集完成后放入-80度冰箱。待检。
　　结果:
　　1.步态测试结果:与假手术组相比，6-OHDA损毁组大鼠显示出增加的步态基数（base of support，BOS，后肢）;减少的步幅(stride)、最大接触面积和强度（左前肢）(P＜0.05)。与刺激前相比，低频刺激PPN明显改善BOS和最大接触面积(P＜0.05)，对其他参数没有影响。
　　2.神经递质结果:与假手术组相比，6-OHDA损毁大鼠Glu和γ-GABA水平显著升高，ACh水平明显降低(P＜0.05)，NA无变化。与刺激前相比，低频刺激PPN明显改善Glu浓度(P＜0.05)，轻微改善ACh浓度，对其他参数无影响。
　　结论:
　　本研究展示低频刺激PPN能够改善PD大鼠部分步态缺陷，支持低频刺激PPN能够改善PD步态缺陷的建议;本研究也显示低频刺激PPN再平衡PPN-VL通路上Glu和ACh浓度，该现象提供了PD中PIGD潜在机制的一个可能的视角。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

第三章 结果

3．1 大鼠的剔除情况

3．2 免疫组化染色结果

3．3 尼氏染色结果

3．4 大鼠自动步态检测结果

3．5 大鼠神经递质检测质谱图

3．6 大鼠神经递质检测结果

第四章 讨论

4．1 低频刺激PPN的行为学效应

4．2 低频刺激PPN对神经递质的效应

4．3 技术说明

第五章 结论

参考文献

综述 运动丘脑整合运动相关输入信息

中英文缩略词对照表

攻读硕士期间的研究成果

致谢

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