UGT酶与外排转运蛋白在田蓟苷与刺槐素的肠道循环处置中的作用及机制

摘要

目的:
　　本文主要考察黄酮苷类物质田蓟苷与其苷元刺槐素的体外Ⅱ相代谢特征。采用Caco-2细胞模型，研究参与三个循环的外排蛋白，以及黄酮苷类物质进入细胞的方式。同时以其为模型药物，采用大鼠在体肠灌流模型，考察肝肠循环、肠肠循环与局部循环在体内能否同时调控黄酮类化合物的处置过程。
　　实验方法:
　　1.田蓟苷与刺槐素UGT酶的代谢机理研究
　　采用人肝微粒体、人肠微粒体以及人源化UGT同工酶对田蓟苷与刺槐素进行体外葡萄糖醛酸化孵育，研究田蓟苷与刺槐素的葡萄糖醛酸化代谢特征。以高分辨质谱(Q-TOF)鉴定代谢产物的结构，初步确认参与主要代谢的UGT酶亚型。考察主要UGT亚型、人肝微粒体、人肠微粒体的酶代动力学以及种属性别差异。
　　2.转运蛋白对田蓟苷与刺槐素转运的调控机制研究
　　以Caco-2细胞裂解液(Caco-2 cell lysate)对田蓟苷与刺槐素进行酶代动力学考察。采用Caco-2细胞模型，研究田蓟苷与刺槐素的转运特征。研究MRPs，BCRP对刺槐素代谢产物的外排作用以及葡萄糖转运体对田蓟苷的转运作用。
　　3.肠道循环对田蓟苷与刺槐素的处置机制研究
　　采用大鼠在体肠灌流模型以及一系列水解实验，研究田蓟苷在大鼠肠道的吸收与代谢特征。共同灌流β-gus酶抑制剂、乳糖根皮苷水解酶(lactase phlorizinhydrolase，LPH)抑制剂，考察黄酮苷类物质田蓟苷的水解、吸收、代谢与外排是否受影响，研究田蓟苷与刺槐素能否在体内同时参与肝肠循环、肠肠循环以及局部循环。
　　实验结果:
　　1.田蓟苷与刺槐素的UGT代谢机理研究
　　经Ⅱ相代谢体系孵育后，代谢产物所出现的准分子离子峰与碎片离子峰均符合连上一分子葡萄糖醛酸的结构，可判定为田蓟苷与刺槐素的葡萄糖醛酸苷。表明田蓟苷与刺槐素在体外葡萄糖醛酸化代谢体系中分别产生了单葡萄糖醛酸结合产物。
　　我们选用12种重组人源化UGT亚酶进行体外孵育，发现以UGT1A8进行孵育时，田蓟苷与刺槐素的葡萄糖醛酸苷的生成量最大，表明UGT1A8是主要负责田蓟苷与刺槐素代谢的UGT亚型。随后，以UGT1A8、人肝微粒体与人肠微粒体对其进行酶代动力学考察，发现田蓟苷的酶代动力学符合米氏方程酶动学模型(Michaelis-Menten)，田蓟苷的清除率在UGT1A8中最高，人肠微粒体次之，人肝微粒体再次之。而刺槐素的酶代动力学符合底物抑制酶动学模型(substrate inhibition)，刺槐素的清除率在人肝微粒体中最高，UGT1A8次之，人肠微粒体再次之。
　　在种属性别代谢差异研究中，田蓟苷与刺槐素在雌性种属的代谢基本高于雄性种属。在雄性肝微粒体中，田蓟苷与刺槐素在人体的代谢速率与狗的代谢速率最接近;在雌性肝微粒体中，田蓟苷在人体的代谢速率与豚鼠和狗的最接近。刺槐素在人体的代谢速率与小鼠和狗的最接近。选用大鼠、小鼠的肠道微粒体对田蓟苷与刺槐素的代谢速率进行研究，结果发现雌性种属的代谢速率略高于雄性种属速率，大鼠的代谢速率普遍高于小鼠。
　　2.转运蛋白对田蓟苷与刺槐素转运的调控机制研究
　　采用Caco-2 cell lysate对田蓟苷与刺槐素进行酶代动力学实验，发现田蓟苷经Caco-2 cell lysate孵育后，检测不到其葡萄糖醛酸苷。刺槐素在Caco-2 celllysate中可生成2个葡萄糖醛酸化代谢产物，且代谢速率较快。
　　在Caco-2细胞转运实验中，刺槐素在Caco-2细胞中可迅速代谢为葡萄糖醛酸苷并且被外排，加入A面外排蛋白MRP2和B面外排蛋白MRP3的抑制剂以及A面外排蛋白BCRP的抑制剂后，刺槐素葡萄糖醛酸苷在Caco-2细胞上的外排率、转运量、Fmet值显著下降，细胞内刺槐素葡萄糖醛酸苷含量显著增高，提示着MRP2，MRP3与BCRP很可能是负责刺槐素葡萄糖醛酸苷外排的外排蛋白。
　　另外，田蓟苷能以原型的形式进入Caco-2细胞，但细胞内含量仅为给药量10％左右。加入A面葡萄糖转运体SGLT1的抑制剂和B面葡萄糖转运体GLUT2抑制剂，田蓟苷的转运量和细胞内含量均无显著变化。表明田蓟苷可以原型的形式进入细胞，但SGLT1和GLUT2很可能不是负责其转运的葡萄糖转运体。
　　3.肠道循环对田蓟苷与刺槐素的处置机制研究
　　在大鼠在体肠灌流模型中灌流田蓟苷单体，在灌流液中，除了田蓟苷原型外，还存在苷元刺槐素以及大量刺槐素的葡萄糖醛酸苷。在胆汁中，还存在田蓟苷的葡萄糖醛酸苷。田蓟苷的吸收率与刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率符合十二指肠、空肠、回肠以及结肠逐渐下降的趋势。田蓟苷在十二指肠、空肠的吸收率50％左右，而结肠的吸收率仅为15％左右。刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率在十二指肠约20％，在空肠几乎没有外排。
　　共同灌流田蓟苷与20、40与80 mM LPH酶抑制剂葡萄糖酸内酯后，灌流液中田蓟苷的吸收率与刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率显著下降，胆汁中刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率也显著下降，提示着LPH在水解田蓟苷的过程中发挥着显著作用，可将田蓟苷水解成刺槐素，再参与肠道循环。
　　灌流液与胆汁样品中加入来自大肠杆菌的β-gus后，刺槐素葡萄糖醛酸苷与田蓟苷葡萄糖醛酸苷明显减少，药物原型刺槐素与田蓟苷的明显增加，表明两者的葡萄糖醛酸苷均可被细菌的β-gus水解成药物原型。提示着胆汁或肠腔中的刺槐素葡萄糖醛酸苷可被β-gus水解成苷元，苷元被肠道重吸收，再被UGT代谢成刺槐素葡萄糖醛苷，随后经肝脏从胆汁外排，流入肠道，从而形成肝肠循环。
　　水解实验中已证明肠腔中的葡萄糖醛酸苷可被β-gus水解成药物原型。当灌流田蓟苷与β-gus抑制剂葡萄糖二酸单内酯(SCL)后，结肠中刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率均显著下降。证明了当β-gus酶受抑制后，刺槐素葡萄糖醛酸苷水解生成的刺槐素减少，刺槐素进入细胞、发生代谢以及外排的葡萄糖醛酸苷也会减少，因此刺槐素葡萄糖醛酸苷在结肠的外排率显著下降。实验结果表明肠腔中的刺槐素葡萄糖醛酸苷被来源于细菌的β-gus水解成刺槐素，刺槐素在结肠段被重吸收，形成肠肠循环。
　　以空白灌流液孵育刺槐素葡萄糖醛酸苷，刺槐素葡萄糖醛酸苷可在小肠空白灌流液中被大量水解为刺槐素，且水解速率高于结肠段。加入β-gus抑制剂SCL后，水解得到明显抑制。但将灌流液过滤除菌后，水解速率无显著下降，提示着细菌分泌的β-gus并不是β-Gus的唯一来源，β-gus很可能来源于小肠肠道黏膜细胞分泌的β-gus。灌流田蓟苷与β-gus抑制剂SCL后，十二指肠、空肠、回肠中刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排率均显著下降。结果表明肠腔中的刺槐素的葡萄糖醛酸苷可被来源于小肠黏膜细胞的β-gus水解成苷元刺槐素，刺槐素被小肠段重新吸收，形成局部循环。
　　四、结论
　　1.黄酮苷类物质田蓟苷与其苷元刺槐素在体外可发生葡萄糖醛酸化反应。UGT1A8是参与两者葡萄糖醛酸化的主要UGT亚型。刺槐素比田蓟苷在肠道以及肝脏更容易发生葡萄糖醛酸化反应。田蓟苷与刺槐素存在明显的种属及性别差异。对于这两种化合物来说，狗的代谢速率与人最接近，雌性种属的代谢速率高于雄性种属。
　　2.刺槐素在Caco-2细胞中可发生葡萄糖醛酸化代谢与外排，外排蛋白MRP2、MRP3与LTC4很可能参与刺槐素葡萄糖醛酸苷的外排。田蓟苷可以原型的形式进入Caco-2细胞中，但不能发生葡萄糖醛酸化反应或反应速率极低。田蓟苷可能不是葡萄糖转运体SGLT1和GLUT2的底物，仍需更多的实验探索其进入细胞的途径。
　　3.田蓟苷和刺槐素在大鼠体内也可发生葡萄糖醛酸化代谢与外排，在肠道和肝脏可经历肝肠循环、肠肠循环以及局部循环。首先，田蓟苷被LPH酶水解生成苷元刺槐素。被水解后，刺槐素被小肠上皮细胞快速吸收并扩散入血，到达肝脏。刺槐素在肠道细胞与肝脏细胞中均可被快速代谢生成葡萄糖醛酸苷，其极性与分子量较大，在肝脏细胞被代谢生成的葡萄糖醛酸苷被外排到胆汁中，流入肠腔，随后，葡萄糖醛酸苷可被结肠中来源于细菌的β-gus水解生成苷元刺槐素，被结肠段重新吸收（肝肠循环）。另外，在肠黏膜细胞被代谢生成的葡萄糖醛酸苷也被外排到肠腔中，其也可被结肠中来源于细菌的β-gus和小肠中游离的β-gus水解生成刺槐素，刺槐素可在结肠（肠肠循环）或小肠（局部循环）中被重新吸收，完成三个循环的过程。
　　结论：
　　田蓟苷与刺槐素在体内可经历广泛的代谢与外排，并且同时参与三个循环的过程。三个循环的机制能延长药物在肝肠的保留时间与半衰期，增强药理活性。寻找更多能同时参与三个循环的化合物，有利于提高药物肝肠局部生物利用度，对肝肠疾病的治疗具有重要指导意义。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 田蓟苷与刺槐素的药理作用

1．2 田蓟苷与刺槐素的药代动力学研究

1．3 黄酮类化合物的生物利用度屏障

1．4 黄酮类物质参与的肝肠循环、肠肠循环以及局部循环

1．5 研究药物吸收与代谢的技术

第二章 立题依据

第三章 田蓟苷与刺槐素的UGT代谢机理研究

3．1 实验材料与仪器

3．2 溶液的配制

3．3 方法学考察

3．4 葡萄糖醛酸化代谢体系的建立

3．5 LC／MS／MS及紫外光谱鉴定田蓟苷与刺槐素的葡萄糖醛酸化代谢产物

3．6 田蓟苷与刺槐素的UGT代谢特征研究

3．7 田蓟苷与刺槐素的代谢种属性别差异研究

3．8 讨论与总结

第四章 转运蛋白对田蓟苷与刺槐素的调控机制研究

4．1 实验材料与仪器

4．2 溶液的配制

4．3 UPLC-MS／MS方法的建立

4．4 Caco-2细胞系的建立

4．5 田蓟苷与刺槐素在Caco-2细胞裂解液上的代谢

4．6 Caco-2细胞转运实验

4．7 刺槐素在Caco-2细胞裂解液中的酶代动力学

4．8 刺槐素在Caco-2细胞上的吸收与代谢

4．9 田蓟苷在Caco-2细胞上的吸收转运

4．10 讨论与总结

第五章 肠道循环对田蓟苷与刺槐素的处置机制研究

5．1 实验材料与仪器

5．2 溶液的配制

5．3 方法学考察

5．4 大鼠在体肠灌流模型

5．5 田蓟苷在大鼠肠道的吸收与代谢研究

5．6 LPH抑制剂对田蓟苷的吸收与代谢的影响

5．7 β-葡萄糖醛酸酶对田蓟苷或刺槐素葡萄糖醛酸苷的水解作用

5．8 β-gus抑制剂与LPH抑制剂共同灌流对田蓟苷的吸收与代谢的影响

5．9 肝肠循环、肠肠循环与局部循环共同调控田蓟苷在肝肠的处置

5．10 讨论与总结

结论与展望

参考文献

缩略词

攻读学位期间成果

致谢

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