二氧化钛纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞及成骨细胞的影响

摘要

目的：
　　1.采用阳极氧化法成功制备不同管径的二氧化钛纳米管
　　2.探索不同管径的二氧化钛纳米管对淫羊藿苷的负载及缓释能力
　　3.探索淫羊藿苷改性后的二氧化钛纳米管对骨髓间充质干细胞的影响
　　4.采用旋转涂布法成功构建壳聚糖/明胶多层膜结构
　　5.探索壳聚糖/明胶多层膜对淫羊藿苷缓释时间的影响
　　6.壳聚糖/明胶复合涂层改性二氧化钛纳米管对成骨细胞的影响
　　本论文主要包括以下两章内容:
　　第一章 二氧化钛纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的影响
　　方法：
　　1.骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定
　　1)骨髓间充质干细胞的分离培养
　　无菌条件下分离SD大鼠的胫骨及股骨，剪掉其干骺端，使用注射器吸取完全培养基反复冲洗骨髓腔。将含有骨髓的完全培养基离心后重悬，37℃、5％CO2孵箱内常规培养。
　　2)生长曲线的测定
　　取第2代生长状态良好的细胞，采用MTT法检测细胞培养1、3、5、7、9d后的吸光光度值，绘制细胞生长曲线。
　　3)表面标志物的检测
　　取第3代生长状态良好的细胞，流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志物CD29、CD44、CD90以及造血干细胞表面标志物CD45和CD34的表达。
　　4)多向分化能力的检测
　　取第2代骨髓间充质干细胞，以5×104/孔的密度接种于培养皿中，成骨诱导培养21 d，成脂诱导培养14d，分别使用茜素红及油红“O”染色，倒置显微镜下观察。
　　2.TiO2纳米管的制备及淫羊藿苷的负载
　　1)TiO2纳米管的制备
　　通过阳极氧化法在纯钛片表面分别制备30 nm和80 nm两种不同管径的纳米管，得到表面规整的纳米结构形貌。
　　2)淫羊藿苷的负载
　　采用无水乙醇/DMSO作为有机溶剂溶解淫羊藿苷，并通过物理吸附的方法将钛片浸泡于不同浓度的淫羊藿苷溶液中，超声处理后于空气中干燥。
　　3) TiO2纳米管的表征
　　通过场发射扫描电镜观察阳极氧化处理前后钛片表面形貌，通过水接触角分析仪测定淫羊藿苷负载后各组钛片表面的亲水性。
　　4)淫羊藿苷缓释时间的检测
　　分别将负载不同浓度淫羊藿苷的钛片置于PBS缓冲溶液中，于预定的时间点取出PBS溶液，采用高效液相色谱仪测定淫羊藿苷的缓释浓度。
　　3.TiO2纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞粘附、增殖、迁移及分化的影响
　　1)细胞骨架观察
　　将细胞以1×104/孔的密度接种于钛片上，培养24 h使用4％多聚甲醛进行细胞固定，加入TRITC Phalladin避光染色40 min，再加DAPI染色约1 min，PBS缓冲液冲洗。倒置荧光显微镜观察细胞粘附伸展的形态。
　　2)细胞迁移实验
　　将钛片置于24孔培养板中，每孔加入1×105/mL细胞悬液1mL。培养36h后，采用已灭菌的20μL枪头垂直于钛片划痕，继续培养24 h后进行染色，倒置荧光显微镜下观察。
　　3)细胞粘附与增殖实验
　　将生长状态良好的细胞接种子各组钛片表面进行培养，分别于选定的时间点采用CCK-8试剂检测细胞的吸光光度值，计算细胞的粘附及增殖水平。
　　4)成骨相关基因的表达
　　采用qRT-PCR法检测各组钛片表面细胞表达成骨相关基因骨钙素、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨涎蛋白以及Runt相关基因2的水平变化。采用碱性磷酸酶试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性的差异。
　　5)统计分析
　　采用SPSS20.0软件对所得数据进行统计学分析，测定结果均以(x)±s表示，组间采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，检验方差齐性，如果方差齐则对样本均数进行两两比较的LSD检验;如果方差不齐则采用Dunnett'sT3检验进行两两比较，假设检验为双侧检验，检验水准α=0.05。
　　第二章 壳聚糖/明胶多层膜改性二氧化钛纳米管对成骨细胞的影响
　　方法：
　　1.大鼠原代成骨细胞的分离培养及鉴定
　　本实验通过胰蛋白酶、胶原酶消化法获得SD乳鼠的颅骨成骨细胞，采用差速贴壁法纯化成骨细胞，观察其形态学特性。通过碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色以及矿化结节茜素红染色对成骨细胞特性进行鉴定。
　　2.壳聚糖/明胶多层膜改性TiO2纳米管的制备及表征
　　1)配制壳聚糖溶液和明胶溶液，浓度均为10 mg/mL。采用旋转涂布法在纳米管表面交互涂布壳聚糖和明胶，旋转速度为4000 rpm，每层旋转时间为40 s。共涂布层数记为T/(Chi/Gel)5Chi和T/ICA/(Chi/Gel)5Chi。
　　2)采用接触角分析仪测量水滴在钛片表面的静态接触角大小;X射线光电子能谱仪分析各组钛片表面元素的化合状态;原子力显微镜对各组钛片表面进行面扫描，分析钛片表面形貌结构及表面粗糙度;高效液相色谱仪测定淫羊藿苷的缓释时间。
　　3.壳聚糖/明胶多层膜改性TiO2纳米管对成骨细胞粘附、增殖及分化的影响
　　1)细胞骨架
　　取生长状态良好的成骨细胞以2×104/mL的密度接种于钛片上，培养1d后取出钛片，进行免疫荧光染色，倒置荧光显微镜观察细胞形态。
　　2)细胞增殖
　　取第3代生长状态良好的成骨细胞，以2×104/mL的密度接种于各组钛片表面，分别培养1、3、5、7d，采用CCK-8试剂检测成骨细胞相对增殖水平。
　　3)成骨相关基因表达
　　qRT-PCR法检测各组钛片表面成骨基因Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨保护素及破骨细胞分化因子RANKL mRNA水平的表达。
　　4)碱性磷酸酶活性检测
　　分别在培养7d和14d后收集细胞培养液，根据试剂盒说明检测各组碱性磷酸酶分泌量。
　　5)Western Blot检测成骨相关蛋白表达
　　细胞接种于各组钛片表面，培养10d后提取细胞内的蛋白，通过Western Blot检测各组细胞骨桥蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达水平。
　　6)统计分析
　　采用SPSS20.0软件对所得数据进行统计学分析，测定结果均以(x)±s来表示，组间采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，检验方差齐性，如果方差齐则进一步对样本均数进行两两比较的LSD检验;反之，如果方差不齐则采用Dunnett，s T3检验进行两两比较，假设检验为双侧检验，检验水准α=0.05。
　　结论：
　　1.通过全骨髓贴壁培养法成功获得骨髓间充质干细胞。
　　2.采用阳极氧化法成功制备TiO2纳米管，并通过物理吸附法负载淫羊藿苷。各组纳米管的淫羊藿苷可以缓释长达3d。
　　3.TiO2纳米管负载淫羊藿苷可以提高骨髓间充质干细胞的粘附、迁移及矿化相关基因的表达。
　　4.通过酶消化法成功获得原代成骨细胞，并通过差速贴壁法纯化细胞。
　　5.通过旋转涂布法成功构建壳聚糖/明胶多层膜结构，多层膜结构延长了淫羊藿苷的缓释时间，可缓释5d。
　　6.壳聚糖/明胶多层膜改性后的纳米管及淫羊藿苷的负载有利于成骨细胞的增殖及粘附，可以上调矿化相关蛋白的表达。

目录

摘要

前言

第一章 二氧化钛纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞的影响

实验一 骨髓间充质干细胞的原代培养与鉴定

实验二 二氧化钛纳米管负载淫羊藿苷的制备及表征

实验三 TiO2纳米管负载淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞粘附、增殖、迁移及分化的影响

第二章 壳聚糖／明胶多层膜改性TiO2纳米管对成骨细胞的影响

实验一 原代成骨细胞的培养及鉴定

实验二 壳聚糖／明胶复合涂层对纳米管的改性及表征

实验三 壳聚糖／明胶多层膜改性后的纳米管对成骨细胞粘附、增殖及分化的影响

参考文献

全文总结

附录

攻读硕士学位期间成果

致谢

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