基于光激化学发光免疫分析技术的酪氨酸激酶通路蛋白蛋白相互作用检测试剂的研制

摘要

目的:
　　本研究实验构建了重组真核表达质粒。并将重组真核表达质粒瞬转转染到293T细胞中进行蛋白表达，并且对光激化学发光免疫分析(AlphaLISA)技术体系进行优化，最后利用AlphaLISA技术对JAK1蛋白质以及通路蛋白的相互作用进行检测，为进一步研究JAK1蛋白通路以及疾病的发生奠定基础。
　　方法:
　　1 真核表达JAK1与STAT3
　　1.1 从Hela细胞中提取总的RNA，通过RT-PCR获得JAK1与STAT3基因全长cDNA序列，并将其克隆至真核表达载体PENTER中，构建重组质粒。将真核重组表达质粒转染293T细胞，转染后检测蛋白转染和在293T细胞中的表达情况。
　　1.2 在表达过程中进行转染试剂的优化，按照罗氏转染试剂说明书，严格操作进行真核表达质粒转染，分别按照质粒跟转染试剂比例为i∶1，1∶2与1∶3加入对应罗氏转染试剂，轻柔混合，静置30min后，缓慢滴加入细胞中进行转染。最后用免疫印迹方法显示结果，建立出最佳的转染试剂与质粒的转染比例。
　　1.3 在表达过程中进行转染时间的优化，在最佳转染试剂用量的前提下，将重组质粒分别转染293T细胞24h，36h，48h后收细胞裂解液，利用免疫印迹方法显示结果，建立最佳的转染时间。
　　1.4 利用免疫共沉淀检测JAK1与STAT3的相互作用，收集JAK1与STAT3质粒共转染的293T细胞裂解液，用STAT3的抗体进行反应，免疫印迹用JAK1的抗体进行检测。
　　2 光激化学发光免疫分析技术的建立与优化
　　采用AFP靶标双抗体夹心法建立并优化光激化学发光免疫分析试剂。
　　2.1 参考标准品用标准品缓冲液(7.5％ BSA、0.9％NaCl、50mmol/L Tris-HCl、0.05％ NaN3、0.01％Tween-20，pH7.8)将AFP抗原配制成0，5，20，125，250，500 U/L系列参考标准溶液，每瓶1mL分装冻干4℃保存。
　　2.2 抗体与受体微球连接将0.2 mg的AFP包被抗体加到有滤膜的离心管中，8000g离心6 min，用连接缓冲液pH5.0，0.1 mol/L的MES重复洗涤6次后，将1mg的受体微球加入到抗体溶液中，再加入10μL25 mg/mL NaBH3CN（用MES配制）、1.25μL10％的Tween-20，用缓冲液MES将体积补充到200μL，放置在37℃避光振荡孵育48 h。加入用0.8 mol/L NaOH配制的10μL65 mg/mL CMO封闭液封闭未结合位点，放置37℃避光孵育1h后进行洗涤，即能得到已连接抗体的受体发光微球，将受体发光微球浓度调整为5 mg/mL。
　　2.3 抗体与生物素连接将1mg标记抗体加入到带有滤膜的离心管中，以8000g离心6 min。用生物素标记缓冲液(0.1 mol/L、pH9.5的Na2CO3/NaHCO3)重复洗涤6次后，在抗体溶液中加入用二甲亚砜(DMSO)配制的10μL22 mg/mL活化生物素，放置室温避光振荡孵育4h后用PBS洗涤，并将其抗体浓度调整为0.5 mg/mL。
　　2.4 光激化学发光免疫分析技术体系反应时间的优化
　　将反应时间设置梯度10min，15min，30min建立出最佳的反应时间;
　　2.5 受体微球连接抗体的量的优化
　　保持发光微球的说明书用量为1mg，将AFP连接抗体制备一系列用量200μg，150μg，125μg，100μg，分别按照以上受体微球连接抗体的方法进行连接。向Optiplates微孔板中分别依次加入25μL受体发光微球化抗体、25μL生物素化抗体、25μL的AFP抗原，加贴封纸片，放置于37℃恒温振荡箱内避光振荡孵育15 min。在黑暗条件下加入175μL链霉亲和素化的供体感光微球，加贴封纸片。反应微孔条在37℃恒温振荡箱内避光振荡孵育15 min。放置于检测仪器2300EnSpireTM上检测信号值。保持AFP连接抗体用量为125μg的条件下，将受体微球制备成一系列用量1mg，800μg，600μg，400μg，分别按照受体微球连接抗体的方法进行连接。把受体微球和AFP抗体的用量同时下调为之前的1/5，即受体微球用量为200μg，AFP抗体用量为25μg。同时设置了AFP抗体用量为30μg作为对照组。
　　2.6 生物素化的抗体量的优化
　　为了降低连接生物素的抗体的用量，我们将生物素与抗体的用量同时下降一定的比例。建立出最佳的生物素化抗体的量。
　　2.7 不同缓冲液的优化
　　为了选择最佳的反应液体环境，我们把PBS与分析缓冲液做了对比。建立最佳的反应缓冲液。
　　3 蛋白质相互作用的检测
　　在光激化学发光免疫分析技术体系完成优化的条件下。
　　3.1 把JAK1的抗体与感光微球相连接，同时把GHR，IL4R，CSF3R，IL10RA，IL2RB等的抗体连接在发光微球上。检测蛋白 JAK1与蛋白GHR，IL4R，CSF3R，IL10RA，IL2RB的相互作用。
　　3.2 把STAT3抗体连接在发微球上，检测蛋白JAK1与蛋白STAT3的相互作用。
　　3.3 把JAK2抗体连接在生物素上，检测蛋白STAT3与蛋白JAK2的相互作用。
　　结果:
　　1 经PCR，双酶切鉴定JAK1与STAT3重组质粒克隆正确，并且能够在293T细胞中稳定表达，免疫印迹检测可在对应位置看到目的蛋白，最佳的转染试剂用量是转染试剂∶质粒为3∶1，最佳转染时间为48h。
　　2 利用AFP靶标建立的光激化学发光免疫分析技术体系构建并且优化，15min的反应时间荧光置最强;抗体连接受体微球的用量下调为抗体25μg连接200μg受体微球，跟200μg抗体连接1mg受体微球的荧光值相差不大;生物素连接抗体的用量下调为抗体25μg，跟130μg抗体连接生物素的荧光值相差不大。
　　3 在优化完成的光激化学发光免疫分析技术体系的前提下，能够检测出蛋白JAK1与通路的相互作用，并且能够检测出STAT3与JAK2的蛋白相互作用。
　　结论:
　　成功获得JAK1与STAT3基因全长序列，并成功构建PENTER-JAK1，PENTER-STAT3的真核重组表达质粒，并在真核细胞293T中获得有效表达。并且优化出最佳的转染试剂和质粒比例为3∶1，最佳转染表达时间为48h。利用AFP靶标成功构建光激化学发光免疫分析技术体系，并优化出最佳反应时间为15min;最佳连接用量为25μg抗体连接200μg受体微球;最佳生物素化抗体用量为25μg抗体连接2.5μg生物素;分析缓冲液作为反应缓冲液优于PBS。能够检测出蛋白JAK1与通路蛋白的相互作用，并且能够检测出STAT3与JAK2的蛋白相互作用。为进一步研究JAK1蛋白质与通路蛋白相互作用奠定了基础。

目录

摘要

前言

第一章 JAK1与STAT3的克隆以及真核表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 小结

第二章 光激化学发光免疫分析技术体系优化及检测蛋白质相互作用

1 材料

2 方法

3 优化

4 结果

讨论

参考文献

中英文缩略词

硕士期间论文发表情况

致谢

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