载DOX/IR-780脂质体的制备及其在乳腺癌光热-化疗联合治疗中的应用

摘要

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，其主要治疗方式是手术、放疗、化疗。然而，手术治疗和放疗、化疗对病人损伤较大，且化疗普遍面临着多药耐药的问题。因此，寻找一种非侵入的病人能耐受的肿瘤治疗方法是临床研究的热点。热疗是通过各种方法使全身和（或）局部组织加热至有效治疗的温度范围并维持一定时间来杀灭肿瘤细胞的一种方法。热疗本身对肿瘤细胞有直接的杀伤作用，热疗能使癌细胞的线粒体膜、溶酶体膜、内质网膜发生破坏，并且由于溶酶体酸性水解酶的大量释放，导致胞膜破裂，胞浆外溢;造成DNA损伤的增加及抑制DNA的合成;影响相关基因，促进肿瘤细胞凋亡。激光热疗相较于手术、放疗、化疗，有着无创或微创，恢复时间短，并发症少的优点。但由于肿瘤内部热分布不均匀，尤其是在大血管周边区域，热量随着血液循环消散，单纯热疗很难杀死所有肿瘤细胞，治疗结果差异大。因此，仍需要联合其他治疗方法来提高热疗的疗效，临床研究表明，热疗-化疗的联合治疗可以明显增强抗肿瘤疗效。
　　本研究设计并构建了一种基于温度敏感性脂质体载阿霉素和IR-780的肿瘤热疗化疗联合治疗的药物控释系统。该系统中，脂溶性的IR-780包封在脂质双层中，水溶性的化疗药阿霉素(Doxorubicin，DOX)包裹在脂质体的亲水内核中。该系统可利用脂质体高效负载化疗药物，在近红外激光照射下光热制剂吸热同时促进温度敏感性脂质体的药物释放。经过和修饰后的纳米粒具有很好的生物相容性和很低的生物毒性，可避免单核巨噬系统的吞噬。在细胞学实验和动物实验中，该系统能够同时发挥热疗与化疗的联合治疗效果，热化疗相比单纯的化疗或热疗，可显著提高抗肿瘤效果。
　　第一章:载DOX/IR-780脂质体的制备与表征
　　目的:
　　制备DOX/IR-780脂质体并进行表征，探索其用于乳腺癌光热-化疗的可行性。
　　方法:
　　一、主要试验材料
　　实验材料:磷脂(DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物。
　　实验仪器:恒温金属浴;Malvern激光粒度仪;荧光分光光度计;红外热像仪。
　　二、实验方法
　　采用薄膜水化法制作DOX/IR-780温敏脂质体(DOX-IR-780temperature-sensitive-liposomes， DITSL)及 DOX温敏脂质体(DOXtemperature-sensitive-liposomes， DTSL)、 IR-780温敏脂质体(IR-780temperature-sensitive-liposomes，ITSL)并对各脂质体进行表征。用Malvem激光粒度仪测得各脂质体的粒径、表面电位及多分散系数。同时对各脂质体的紫外吸光特性及光热效应进行测量。并验证DITSL在高温及激光辐照下的药物释放可控性。
　　结果:
　　1.成功制备载有DOX和IR-780脂质体，其中IR-780溶在脂质体脂质双层中，DOX包封在脂质体的亲水内核中。
　　2.DITSL粒径在138.98nmnm左右，PDI约0.32。DTSL、ITSL和空白脂质体的粒径均小于100nm。所有脂质体略带负电位。各载药温敏脂质体药物包封率均在90％以上。DITSL同时在793nm和492nm有显著吸收峰，符合IR-780和DOX的吸收特性。
　　3.在0.8W/cm2激光照射五分钟内，DITSL和ITSL溶液温度升高迅速，而DTSL和PBS组只有少量的温度升高。
　　4.在37℃、42℃和50℃金属浴的条件下，DOX/IR-780温敏脂质体(DOX/IR-780 Temperature-Sensitive-Liposomes，DITSL)在37℃时脂质体释药缓慢，而在42℃和50℃药物迅速释放。同时，DITSL在没有激光辐照的条件下，5分钟的DOX累积释放率为8.9％。而在激光辐照的条件下，DOX迅速从DITSL释放，局部药物浓度随之增高。DTSL由于无IR-780，在激光辐照下药物释放缓慢。说明了DITSL在联合治疗中具有良好的激光可控性及温度敏感性。
　　结论:
　　DITSL具有合适的粒径大小、较高的药物包封率和很好的光热转化效率。同时DITSL具有对温度敏感的特性，其药物释放可被光热治疗控制，适宜用于乳腺癌的光热-化疗联合治疗（热化疗）。
　　第二章:载DOX/IR-780脂质体热化疗治疗乳腺癌的体外实验
　　目的:
　　探讨激光辐照下DOX/IR-780脂质体对乳腺癌细胞的影响。
　　方法:
　　一、主要试验材料
　　实验材料:磷脂(DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物;细胞活性检测试剂盒;凋亡试剂盒;DAPI染料;细胞培养基;胎牛血清;胰酶;乳腺癌4T1细胞。
　　实验仪器:FACSCantoⅡ流式细胞仪;Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜;多功能酶标仪。
　　二、实验方法
　　通过FACSCantoⅡ流式细胞仪检测4T1细胞在孵育不同浓度的DITSL条件下，细胞对药物的摄取情况，并采用激光共聚焦显微镜对药物在细胞内的亚细胞定位进行分析。采用CCK-8方法检测4T1细胞在不同激光辐照强度(0.6W/cm2;0.8W/cm2)下的存活率，通过对凋亡细胞染色直接观察4T1细胞在化疗-光热联合治疗后的凋亡情况。
　　结果:
　　1.4T1细胞对DITSL、DTSL及ITSL的摄取有一定的剂量和时间依赖性。激光共聚焦显示4T1细胞在吞噬DITSL后，脂质体破坏后释放的DOX富集在肿瘤细胞核，而IR-780富集在细胞质中。
　　2.激光和高温可以促进DITSL在4T1细胞内的药物释放。
　　3.与空白对照组相比，温敏脂质体载体及ITSL处理组细胞活性无明显差别，而单纯化疗组与单纯热疗组细胞活性分别下降了40.6％和56.4％。在化疗和热疗联合治疗后，细胞存活率只有19.7％，远低于其他各组。加强激光强度后，单纯热疗组及联合治疗组细胞活性进一步降低。
　　4.与空白对照组相比，热化疗可明显诱导肿瘤细胞凋亡/坏死，细胞凋亡/坏死情况与细胞活性情况一致。
　　结论:
　　热疗联合化疗可明显抑制4T1乳腺癌肿瘤细胞的活性，诱导肿瘤细胞凋亡/死亡。
　　第三章:载DOX/IR-780脂质体热化疗对乳腺癌抑制效应的动物实验
　　目的:
　　探讨DOX/IR-780脂质体热化疗对乳腺癌移植瘤的作用。
　　方法:
　　一、主要试验材料
　　实验材料:磷脂(DSPC，DPPC，MPPC，DSPE-PEG2000);阿霉素;IR-780碘化物;细胞培养基;胎牛血清;胰酶;乳腺癌4T1细胞;兔抗鼠CD31单克隆抗体单步法测凋亡（TUNEL）检测试剂盒;DBA kit;苏木精染色液;伊红染色液。雌性SPF级BALB/c小鼠，鼠龄8～10周龄，体重18～22g，由广东省动物中心提供(SCXY[粤]2013-0002)，饲养在中科院深圳先进技术研究院SPF级实验室。
　　实验仪器:CO2细胞培养箱;超净工作台;离心机;普通光学显微镜;倒置荧光显微镜;石蜡切片机;正置显微镜;Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜;红外热像仪。
　　方法:用BALB/c小鼠建立4T1乳腺癌皮下移植瘤模型，随机将荷瘤小鼠分为(1)对照组;(2)激光组;(3)化疗组;(4) IR-780脂质体组;(5)光热治疗组;(6) DOX/IR-780脂质体组及(7)联合治疗组。各组处理后观察小鼠肿瘤体积和体重的变化情况，记录分析小鼠生存率，研究DOX/IR-780热化疗体内治疗效果。肿瘤组织经H&E染色观察组织形态学变化和TUNEL免疫组化检测组织凋亡情况。同时，各组在治疗后，采用超声造影对基于DITSL的乳腺癌热化治疗的疗效进行评价，并采用B超成像检测肿瘤内部回声的变化。应用CD31免疫组织化学染色检测乳腺肿瘤中新生微血管密度及血管的分布情况。
　　结果:
　　1.以肿瘤切片H&E染色和TUNEL检测来评价小鼠治疗后短期疗效，H&E染色结果可见在热化疗后，小鼠肿瘤组织大部分细胞的细胞核已不见，细胞坏死显著增多。而TUNEL结果也显示在热化疗后，肿瘤组织细胞凋亡增加。
　　2.长期来看，单独化疗或光热治疗后，小鼠肿瘤体积缩小，肿瘤生长受到抑制，而联合治疗之后，小鼠肿瘤较各组体积缩小明显(P＜0.01)。小鼠在热化疗30天的生存率为100％，而PBS的30天生存率为0％。
　　3.处理48h后，超声造影显示热化疗组的肿瘤区域血流灌注减少。治疗48h后的超声成像显示热化疗组肿瘤体积缩小，回声减低。
　　4.CD31免疫荧光染色结果表明，肿瘤组织在DITSL脂质体热化疗后，CD31阳性细胞明显减少，与超声造影结果一致。
　　结论:
　　DITSL热化疗对小鼠乳腺癌具有较强的杀伤作用，表现为肿瘤体积缩小，大量肿瘤细胞凋亡及坏死。超声造影可以用来评价DITSL乳腺癌光热治疗效果，表现为肿瘤血流灌注减少，该结果与免疫组化染色结果一致。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 载DOX／IR-780脂质体的制备与表征

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 脂质体的制作与表征

2．2 激光诱导的体外升温

2．3 DITSL的药物释放特性

3．讨论

3．1 DITSL的物理特性与热疗的关系

3．2 DITSL释药的温度依赖性与近红外可控性

4．结论

参考文献

第二章 载DOX／IR-780脂质体热化疗治疗乳腺癌的体外实验

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 体外细胞摄取

2．2 细胞内的药物释放

2．3 体外化疗、热疗、热化疗治疗

3．讨论

3．1 乳腺癌4T1细胞对DITSL的摄取

3．2 DITSL细胞内药物释放

3．3 热化疗对乳腺癌细胞的体外杀伤作用

4．结论

参考文献

第三章 乳腺癌化疗-光热联合治疗对乳腺癌移植瘤的抑制效应

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2．结果

2．1 热疗和热化疗的体内升温作用

2．2 体内抗肿瘤作用

2．3 肿瘤治疗后的超声成像

2．4 肿瘤血管免疫荧光检测

3．讨论

3．1 热化疗的瘤内升温

3．2 热疗-化疗的协同作用

3．3 热化疗对肿瘤血管的影响及评价

4．结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

声明