血清与关节滑膜组织中Nesfatin-1变化在膝关节骨性关节炎的严重程度中的作用及临床意义

摘要

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种严重的关节疾病，关节软骨破坏，使关节间隙变窄。在严重的情况下，当关节完全失去软骨，关节周围的骨和软组织结构将开始发生变化，这可能导致关节疼痛、肿胀、致残。在美国，60岁或以上的成年人有症状的骨性关节炎发生率大约10％。根据最近的统计，在美国有930万的成年人患有膝关节骨性关节炎。全球OA总人数高达4.0亿以上。在亚洲平均每8个人中就有1人患本病。我国岁老龄化的来临，OA患者逐年增多，估计达2亿左右。男女患病比例为1∶2。随着老龄化社会的到来，人的膝关节骨性关节炎的人数预计在未来几十年里将增加，在2020年，骨性关节炎将被认为是第四大伤残原因。治疗骨性关节炎的目的是缓解疼痛和肿胀，改善关节的活动性。目前的治疗方案，在几个循证临床指南推荐包括减肥、运动、口服药物治疗、局部治疗、腔内注射治疗、非药物治疗和手术治疗。这些不同的干预中，非甾体类抗炎药和关节内注射透明质酸或糖皮质激素在临床的应用更加普遍。然而，这样在某些情况下，治疗可能无效或导致严重不良事件，在这种情况下，我们的研究为骨性关节炎的治疗提供了新的方向。
　　OA发病的中心环节是关节软骨的退变，而原因则是力学和生物学因素共同导致软骨细胞、细胞外基质及软骨下骨的降解与合成失衡。适当运动的力学刺激会限制软骨退变，而创伤及过度负荷会导致软骨破坏，发生OA。研究证明:力学刺激的种类、频率、持续的时间及强度对软骨细胞均有影响。超生理限度的异常应力作用于软骨时，使胶原纤维网架松弛，超微结构破坏，胶原纤维断裂而发生软骨退变。滑液是滑膜关节内的一种清晰的具有高粘性的液体，为关节提供了液态环境。它在滑膜内由滑膜衬里细胞分泌到关节腔内。它具有润滑软骨面的作用，对维持其低摩擦特性至关重要。它作为一种必要的营养物质的运输载体把养料运送到软骨细胞。透明质酸和润滑素等物质是滑膜液的主要成份，这2种物质是决定滑膜液粘度的主要因素。透明质酸是唯一的非硫酸化糖胺聚糖，关节液中存在的量约3.4mg/dl-3.6mg/dl。透明质酸是由氨基葡聚糖和葡萄糖酸组成的，它是由透明质酸合成酶的作用下而形成的，它是关节液和软骨基质的主要成分。通常在骨关节炎的关节中会出现非糜烂性滑膜炎。研究发现，直接和受损的关节软骨相邻的滑膜发生滑膜炎症状更严重。同时，骨关节炎的磨损颗粒和其他物质的降解产物，可刺激滑膜细胞分泌炎性细胞因子，从而增强外周滑膜组织的炎症，促进滑膜纤维化，导致滑膜透明质酸的分解和缺乏或丧失，从而降低其浓度。
　　软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，负责细胞外基质的合成和再生，保持基质的完整性。细胞凋亡是一种正常的生理过程，它是一种由基因控制的程序性细胞死亡过程，而不需要采取主动去清除非细胞过程。正常人关节软骨也会发生细胞凋亡，但检出率非常之低，骨性关节炎患者细胞凋亡较正常关节组织有明显的升高。研究人员进行了测定正常人员和OA患者关节软骨细胞凋亡率分别为2-5％与18-21％，也有研究显示是6.7％和28.7％，但始终表明大量出现病理性细胞凋亡普遍存在于骨关节炎患者。造成这种细胞凋亡现象主要分布在软骨浅层和软骨中间层，这是一氧化氮合酶(iNOS)和NO表达最高的部位，也是蛋白多糖丢失最多的区域。
　　关节软骨是一种非血管组织，具有与免疫系统相隔绝，没有神经和淋巴管的特点。免疫细胞通常不接触软骨细胞和基质，实际上处在免疫隔离形态存在。在侵蚀性骨关节炎的滑膜的病理学研究，发现单核细胞和滑膜组织中淋巴细胞聚集，主要为CD3+T细胞。CD4+T和CD8+T细胞大多存在滑膜衬里层。在骨关节炎动物实验中，发现骨关节炎细胞在软骨多糖和胶原纤维上有一个T细胞反应。一旦软骨细胞受到机械应力或炎症因子的侵袭，软骨细胞和基质暴露于免疫系统，并可释出“自身抗原”，受到免疫细胞所识别，引起自身免疫反应。在侵蚀性骨关节炎的患者中，已发现自身抗体对软骨细胞成分进行攻击。
　　Nesfatin-1是一个82个氨基酸的多肽，是在2006由日本学者oh-i及其同事首先描述，在大鼠与小鼠给药能诱导焦虑，产生恐惧反应，并降低食欲。此外，Bonnet等人在法国的研究发现Nesfatin-1与外周炎症信号有密切关系。Nesfatin能够水解成三个片段，分别为Nesfatin-1、Nesfatin-2和Nesfatin-3。但只有Nesfatin-1具有抑制食欲作用，降低外周炎症信号的作用。最初研究发现Nesfatin-1只存在于下丘脑的神经元当中，然而随着研究深入，发现其还存在于脑干及外周组织。近年的研究发现，Nesfatin-1能够抗炎及抑制细胞凋亡，然而Nesfatin-1在膝关节骨性关节炎中的作用仍未有报道。
　　目的：
　　本研究拟从动物模型角度，探讨膝关节骨性关节炎大鼠血清及滑膜细胞Nesfatin-1水平变化，研究其与滑膜细胞凋亡的关系及通过何种途径进行调控，以为骨性关节炎的病因学研究提供科学依据，为骨性关节炎的治疗提供新方向。
　　方法：
　　通过关节腔注射尿激酶建立膝关节炎大鼠模型，给予Nesfatin-1干预后，使用免疫组化、流式细胞术和western blot检测病理变化、炎症因子及内质网应激和凋亡情况。
　　结果：
　　1.大鼠足跖部出现肿胀，关节明显红肿增粗，活动受限。软骨病理切片镜下显示对照组细胞排列整齐，染色均匀;OA组细胞排列紊乱、软骨有溃疡形成，有炎性细胞浸润。进行关节炎评分OA组符合关节炎的改变。对大鼠膝盖直径进行测量，OA组有显著的增大。
　　2.与Control组比较，OA组的IL-1β、TNF-α血清浓度有着明显的升高，HA血清浓度明显降低。
　　3.与Control组比较，OA组的无论是血清学浓度还是蛋白的表达，Nesfatin-1的水平与对照组比较均有显著的下降。
　　4.Nesfatin-1干预治疗后，细胞凋亡情况明显降低，并随浓度增高而降低，高浓度组细胞凋亡率降低最明显。
　　5.对caspase-3、caspase-7与caspase-9进行检测，可以获得，经过干预后其蛋白表达均有显著的下降，有呈浓度依赖性，随Nesfatin-1浓度增加而降低，以高浓度组蛋白表达下降最为显著。
　　6.分别对IL-1β、TNF-α进行检测，经过干预后其血清浓度均有显著的下降，有这浓度依赖性，随Nesfatin-1浓度增加而降低，以高浓度组蛋白表达下降最为显著。对HA进行检测，其血清浓度随Nesfatin-1浓度增加而增高，其中高浓度组蛋白表达增高最为显著。
　　7.经过干预后，大鼠关节肿胀程度在低浓度组无统计学差异，随着浓度增加，关节肿胀程度显著下降，其中以高浓度组最为明显。
　　8.在关节炎组CHOP与GRP78两个蛋白强表达，随着Nesfatin-1干预后两种蛋白表达量明显降低，两者呈现并有浓度依赖性，在高浓度组降低最为显著。
　　9.在检测CHOP与GRP78蛋白表达中，OA组的两个蛋白表达水平明显高于对照组，两者比较有显著的统计学差异。
　　10.TG刺激后，凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9的表达与对照组比较均有明显的上调，而当加入了Nesfatin-1后，这三组蛋白表达显著降低。
　　结论：
　　1.对大鼠关节腔注射尿激酶能够成功诱导出膝关节骨性关节炎病理状态。
　　2.Nesfatin-1能够降低膝关节骨性关节炎病理过程中炎症反应水平与减少细胞凋亡。
　　3.膝关节骨性关节炎时存在内质网应激。
　　4.Nesfatin-1减少膝关节骨性关节炎炎症因子水平及细胞凋亡的机制之一是抑制内质网应激的活化。

目录

摘要

引言

第一部分 大鼠膝关节炎动物模型的建立及Nesfatin-1的表达

前言

材料与方法

一．大鼠膝关节炎动物模型的建立

二．关节炎评分

三．病理切片制作

四．ELISA检测炎性因子

五．western blot检测Nesfatin-1蛋白表达

六．统计学分析

结果

1．大鼠膝关节骨性关节炎动物模型的建立

2．两组炎症因子水平的改变

3．两组血清及滑膜细胞Nesfatin-1的改变

讨论

第二部分 Nesfatin-1蛋白表达在膝关节骨性关节炎中的作用

前言

材料与方法

一．实验分组

二．ELISA检测炎性因子

三．western blot检测蛋白表达

四．FACS检测细胞凋亡

五．统计学分析

结果

1．不同浓度Nesfatin-1干预后骨膜细胞凋亡情况

2．不同浓度Nesfatin-1干预后血清炎症相关因子变化情况

3．不同浓度Nesfatin-1干预后大鼠关节肿胀程度变化情况

4．不同浓度Nesfatin-1干预后内质网应激情况变化

讨论

第三部分 内质网应激信号通路在Nesfatin-1调控膝关节骨性关节炎滑膜细胞凋亡中的作用

前言

材料与方法

一．滑膜细胞培养实验步骤

二．Western blot

三．统计学分析

结果

1．骨膜细胞内质网应激情况

2．内质网应激在Nesfatin-1调控滑膜细胞凋亡中的作用

讨论

结论

参考文献

致谢

博士在读期间成果

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