高通量基因表达谱测序差异与体外受精-胚胎移植结局相关性研究

摘要

目的：
　　在本研究中，利用基因表达分析技术联合HiSeqTM2000测序系统在10例接受IVF-ET不孕患者中进行检测研究，分为三个阶段检测，分别为进行体外受精-胚胎移植前阶段，阶段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激启动阶段，阶段Ⅱ(StageⅡ);胚胎移植后15天，阶段Ⅲ(StageⅢ)。10例患者妊娠结局为5例妊娠成功，5例妊娠失败。先进行RNA提取，RNA-seq实验、分析，然后利用FastQC package进行原始数据的分析后选出敏感基因，再利用实时定量PCR(qRT-PCR)进行验证的几个检测出差异表达基因的表达水平，并分析相关影响体外受精-胚胎移植妊娠结局的分子机制。此外，确定相关基因可能辅助检测IVF-ET患者妊娠预后，寻找新型的潜在生物标志物。
　　方法：
　　本研究选取的研究对象为2014年1月至2014年6月在大理大学第一附属医院生殖医学科进行体外受精-胚胎移植的不孕患者，共计10例患者入选本研究。依据体外受精-胚胎移植治疗的妊娠结局分为两组，分别为妊娠成功组(pregnancysuccess group，或简称preg group)，以及妊娠失败组(pregnancy failure group，或简称nopreg group)，每组各5例患者。对入选患者的所有相关临床资料进行记录，包括年龄、身高、体重等一般资料，以及其他疾病、服药史、家族史等。
　　将妊娠成功组和妊娠失败组两组患者的样本收集分为三个阶段，分别为进行IVF-ET前阶段，阶段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激启动阶段，阶段Ⅱ(StageⅡ);胚胎移植后15天，阶段Ⅲ(StageⅢ)。卵巢刺激方案应用标准长方案进行控制性超促排卵，阴道超声监测卵泡发育，卵泡成熟在阴道超声引导下进行穿刺取卵，行常规体外授精，18小时后受精检查，然后进行胚胎分级和碎片评估选择优质胚胎进行胚胎移植，在胚胎移植后15d，通过血清中β-hCG检测妊娠成功与否，分别检测其峰值变化和滴度改变。妊娠35天在阴道超声检测胎心活动和孕囊。RNA提取、RNA-seq测序后对原始序列数据进行处理，生物信息学分析包括利用FastQC package进行原始数据的分析、基因表达注释、差异表达基因分析、差异基因表达模式聚类分析以及GO(Gene Ontology)功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析，Real time PCR验证差异表达基因。分析相关影响体外受精-胚胎移植妊娠结局的分子机制，并确定相关基因可能辅助检测IVF-ET患者妊娠预后，寻找新型的潜在生物标志物。
　　结果：
　　1、妊娠成功组(preg group)和妊娠失败组(nonpreg group)两组一般临床资料年龄、不孕年限、BMI、FSF/LH比值、血清E2水平、血清T水平等无统计学差异(P＞0.05)。
　　2、妊娠成功组(preg group)收集卵母细胞62个，成熟卵母细胞52个;妊娠失败组(nonpreg group)收集卵母细胞64个，成熟卵母细胞55个;两组成熟卵形成率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3、两组Gn天数，启动FSH剂量，Gn总量，移植胚胎数，2PN受精率，优质胚胎率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　4、在IVF-ET前阶段，阶段Ⅰ(StageⅠ)中，妊娠成功组总计收集11698976 cleanreads，占原始数据总数的98.62％;妊娠失败组总计收集26502828 clean reads，占原始数据总数的98.4％。卵巢刺激启动阶段，阶段Ⅱ(StageⅡ)，妊娠成功组总计收集3175521 clean reads，占原始数据总数的98.55％;妊娠失败组总计收集12139689 clean reads，占原始数据总数的98.37％。胚胎移植后15天，阶段Ⅲ(StageⅢ)，妊娠成功组总计收集10769344 clean reads，占原始数据总数的98.62％;妊娠失败组总计收集17021605 clean reads，占原始数据总数的98.51％。
　　5、在IVF-ET前阶段Ⅰ(StageⅠ)，妊娠成功组和妊娠失败组分布在参考数据库中基因分别为45.43％和50.14％;卵巢刺激启动阶段，阶段Ⅱ(StageⅡ)，妊娠成功组和妊娠失败组分布在参考数据库中基因分别为50.17％和50.34％;胚胎移植后15天，阶段Ⅲ(StageⅢ)，妊娠成功组和妊娠失败组分布在参考数据库中基因分别为48.72％和53.24％。
　　6、在三个不同阶段中，和参考数据库对比后，两组研究对象中每个样本中约有28-38％100 bp长度的配对clean reads可达到至少90％-100％基因覆盖率。主要基因类型的转录mRNAs表达量低，而仅有少数基因表达量较高。
　　7、经PCA分析（主成分分析）结果显示，妊娠失败组和妊娠成功组在IVF-ET前阶段、阶段Ⅰ(StageⅠ)和卵巢刺激启动阶段、阶段Ⅱ(StageⅡ)具有相似的特征。但是在第三阶段，胚胎移植后15天，阶段Ⅲ(StageⅢ)与其他阶段具有显著性差异(P＜0.05）。
　　8、IVF-ET前阶段、阶段Ⅰ，卵巢刺激启动阶段、阶段Ⅱ，胚胎移植后15天、阶段Ⅲ中分别共计检测了282，208和372个差异表达基因。结果可见，阶段Ⅰ中，共有130个基因表达上调，152个基因表达下调;而在阶段Ⅱ中，共有90个基因表达上调，118个基因表达下调;而在阶段Ⅲ中，共有100个基因表达上调，272个基因表达下调。
　　9、RPKM值散点图确定在三个阶段中，仅有极少的一部分基因是差异表达基因。
　　10、在阶段Ⅰ，IVF-ET前阶段，“周期性进程”(“rhythmic process”)和“蛋白标签”(“protein tag”)相关基因表达上调，“电子载体活性”（“electron carrier activity”）相关基因表达下调。阶段Ⅱ，卵巢刺激启动阶段，“突触部分”(“synapse part”)、“突触”(“synapse”)、“结构分析活性”(“structural molecule activity”)、“抗氧化活性”（“antioxidant activity”）相关基因都表达下调。阶段Ⅲ，胚胎移植后15天，周期性进程”(“rhythmic process”)、“突触部分”（“synapse part”）、“突触”(“synapse”)、“排除活性”(“chemorepellent activity”)相关基因都表达下调。
　　11、在阶段Ⅰ，IVF-ET前阶段的所有差异表达基因中，282个差异表达基因分属于23条显著富集的通路（P＜0.05）。阶段Ⅱ，卵巢刺激启动阶段，208个差异表达基因分属于32条显著富集的富集通路（P＜0.05）。阶段Ⅲ，胚胎移植后15天，372个差异表达基因分属于17条显著富集的富集通路(P＜0.05）。
　　12、在阶段Ⅰ，IVF-ET前阶段，“趋化因子信号通路”(“chemokine signalingpathway”)和“细胞粘附分子通路”(“cell adhesion molecules pathways”);阶段Ⅱ，卵巢刺激启动阶段，“趋化因子信号通路”（“chemokine signaling pathway”）;阶段Ⅲ，胚胎移植后15天，“卵母细胞减数分裂”(“oocyte meiosis”)、“孕酮介导的卵母细胞成熟”(“progesterone-mediated oocyte maturation”pathways)等显著富集。除此之外，多数差异表达基因和阶段Ⅰ中“趋化因子信号通路”(“chemokinesignaling pathway”)、“细胞粘附分子通路”(“cell adhesion molecules pathways”)，以及阶段Ⅱ中“趋化因子-细胞因子受体相互作用信号通路”(“cytokine-cytokinereceptor interaction”)、“趋化因子信号通路”(“leishmariasis”)，以及阶段Ⅲ中“细胞周期”(“cell cycle”)、“卵母细胞减数分裂”(“oocyte meiosis”)相关。
　　13、基于KEGG富集通路分析，选择主要组织相容性复合体-A(HLA-A)、白介素-1β(IL-1β)、主要组织相容性复合体-DQA1(HLA-DQA1)、血红蛋白D(HBD)、微小染色体维持缺陷蛋白4(MCM4)等5个基因对妊娠结局影响最为重要。
　　结论：
　　1、本研究利用HiSeqTM2000测序系统对影响人类IVF-ET妊娠结局的基因表达进行分析，证实在IVF-ET前阶段，即阶段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激启动阶段，阶段Ⅱ(StageⅡ);胚胎移植后15天，阶段Ⅲ(StageⅢ)三个阶段的基因表达有显著差异。
　　2、基因表达改变和机体免疫应答、炎症、卵母细胞减数分裂等相关。
　　3、HBD和MCM4可作为IVF-ET妊娠结局的分子标记物。
　　4、HLA-A和HLA-DQA1与妊娠发育持续密切相关，提示HLA-A和HLA-DQA1也可作为妊娠预测的分子标记物。
　　5、本研究为进一步深入研究影响IVF-ET妊娠结局的分子机制提供了理论基础，并为临床进行IVF-ET的影响因素的研究以及预后分子靶标选择提供了新的研究方向和数据。

目录

摘要

第1章 前言

第2章 实验材料

2．1 临床样本获得

2．2 实验材料

2．2．1 仪器材料

2．2．2 主要试剂

第3章 实验方法

3．1 实验分组和分段样本收集

3．2 卵巢刺激和体外受精-胚胎移植方法

3．3 优质胚胎选择

3．4 胚胎分级和碎片评估标准

3．5 妊娠主要指标检测

3．6 RNA提取

3．7 RNA-seq实验流程

3．8 RNA-seq分析流程

3．9 生物信息学分析

3．10 RaM time PCR验证

3．11 统计学分析

第4章 结果

4．1 各组研究对象一般临床情况分析

4．2 超促排卵方案结果

4．3 IVF-ET周期相关资料分析

4．4 Clean reads收集分析

4．5 对比参考序列结果

4．6 PCA分析

4．7 差异表达基因分析

4．8 差异表达基因确定

4．9 GO分析

4．10 KEGG通路分析

4．11 验证基因选择

4．12 基因验证

4．13 GO ontology分析HLA-A

4．14 GO ontology分析HLA-DQA1

4．15 GO ontology分析IL-1β

4．16 GO ontology分析HBD

4．17 GO ontology分析MCM4

第5章 讨论

第6章 结论

参考文献

文献综述一 高通量基因测序技术研究进展

文献综述二 不孕症和体外受精-胚胎移植技术研究进展

缩略词表

简历成果

致谢

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