新型β-磷酸三钙复合物修复SD大鼠颅骨缺损的实验研究

摘要

目的：
　　本研究所使用的骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠，分离后进行体外培养扩增，与β-TCP材料支架共培养并成骨诱导分化，观察材料对SD大鼠BMSCs增殖及成骨分化的影响。此外，β-TCP搭载BMP-2/PDGF-BB构建组织工程骨修复SD大鼠颅骨标准骨缺损，观察β-磷酸三钙复合材料在骨组织再生修复应用的效果，为骨生物材料的基础研究，成骨及成血管提供实验资料和科学依据。
　　方法：
　　1.SD大鼠骨髓间充质干细胞在β-磷酸三钙复合材料中的增殖及成骨分化
　　材料使用新型β-TCP复合物（CaPfromGEM21），材料预制成直径3.6mm，厚度1.5mm的圆盘形支架，采取双侧股骨、胫骨骨髓，用密度梯度离心法分离并扩增BMSCs，第三代BMSCs做流式细胞学检测表面标记物，后将第三代BMSCs与β-TCP支架于24孔培养板共培养，每个β-TCP支架种植细胞数3*105个，添加成骨诱导培养液（含100nM地塞米松，10mMβ-磷酸甘油，0.05mM抗坏血酸和10nM维生素D3)对BMSCs进行成骨诱导分化21天，对照组采用同样方法将BMSCs种植于材料，使用普通培养液培养。第1、4、7、14、21天根据实验计划需要进行电镜扫描，Live/Dead染色法对细胞生长活性进行检测，观察成骨组及对照组BMSCs增殖。pNpp定量法对碱性磷酸酶(ALP)活性进行检测，通过实时逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定其骨钙素(OC)，Ⅰ型骨胶原(Col-Ⅰ)，碱性磷酸酶(ALP)及RunX-2成骨基因的表达结果。茜素红染色法对在材料支架进行染色并定量成骨过程形成的矿化物，观察BMSCs在材料支架上的成骨诱导分化。
　　2.载骨形态发生蛋白-2/血小板衍生生长因子-BB的β-磷酸三钙复合材料用于修复SD大鼠颅骨标准骨缺损的实验研究
　　材料使用复合了骨形态发生蛋白-2（Bone Morphogenetic Protein，BMP-2）或血小板衍生生长因子-BB（Platelet Derived Growth Factor-BB，PDGF-BB）的β-磷酸三钙材料Calcium Phosphate from Growth-factor Enhanced Matrix21(CaPfromGEM21)，每组材料搭载BMP-2/PDGF-BB中的一种，BMP-2(浓度为10ng/100ng)/PDGF-BB(浓度为0.3ug/3ug)，另设置单纯材料组、空白组各1组，共6组实验组:(1)CaPfromGEM21;(2)CaPfromGEM21+10ng BMP-2;(3)CaPfromGEM21+100ng BMP-2;(4)CaPfromGEM21+0.3ug PDGF-BB;(5)CaPfromGEM21+3ug PDGF-BB;(6)空白组。实验动物为健康的SPF级3月龄雄性Sprague-Dawley大鼠，3％戊巴比妥钠腹腔灌注麻醉动物，用环钻于顶骨两侧制作两个直径为3.6mm的全层圆形骨缺损，两侧缺损随机植入两组不同的实验材料，术后6周处死动物并取出标本进行检测，标本检测方法包括:X线、Micro CT，苏木素-伊红染色（HE染色）及相关的定量分析。
　　结果：
　　体外扩增可见大鼠间充质干细胞生长旺盛，呈长梭形、旋涡状或麦浪状细胞集落成，流式细胞学检测提示采集的细胞符合骨髓间充质干细胞表面标记特点。大体观察可见间充质干细胞在支架上生长增殖活跃，电镜扫描图片可以观察到BMSCs在β-TCP支架表面贴附生长，细胞伸展形态自然，表现出良好的生长活力。Live/Dead染色提示细胞在支架上增殖活跃，活细胞百分数定量结果提示对照组与成骨组之间在1/4/7/14天各时间点的活细胞百分比之间均无统计学差异;视野活细胞数定量结果提示随培养时间延长，组内活细胞数逐渐增加，成骨组第7/14天每视野活细胞数均明显大于第1/4天，两组间比较，同一时间点间均无统计学差异。ALP活性测定提示成骨组ALP活性逐步升高，而对照组则没有明显升高趋势。成骨组第14/21天结果显著大于其他时间点结果，具有统计学意义。qRT-PCR结果提示成骨组各成骨基因在不同时间点达到峰值，成骨组ALP基因表达第四天达峰值，约为第1天5倍。COL-Ⅰ及OC基因表达峰值均出现在第7天，均为第1天表达量6倍，而RunX-2基因峰值出现在第14天，为第1天表达量约3倍。对照组各时间点成骨基因表达量则无明显峰值出现。茜素红染色可见随培养时间延长，材料表面的矿物染色逐渐加深，定量分析提示成骨组第21天矿化定量显著高于成骨组第14天及第7天，两组间同一时间点均有统计学差异。
　　动物手术过程无动物出现麻醉死亡，术后无动物出现感染。X线影像提示各组骨缺损均有不同程度的修复，骨折线逐渐模糊，PDGF-BB组的骨缺损基本修复。Micro CT可见各组骨缺损均有不同程度新生骨长入，新生骨体积定量结果提示添加PDGF-BB组新生骨体积明显高于BMP-2实验组，具有统计学意义(P＜0.05)。HE染色切片各组均未见急慢性炎症细胞浸润，缺损中可见染色均一的新生骨组织，新生骨内及周围可见散在的新生血管及其中的红细胞，新生骨面积百分数提示10ng BMP-2组及0.3ug PDGF-BB组新生骨量百分数均明显大于单纯材料组(P＜0.05)，新生血管密度定量提示4个添加因子的实验组的新生血管密度均明显大于空白组及单纯材料组(P＜0.05)，4个添加因子的实验组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：
　　新型β-磷酸三钙复合物材料细胞毒性小，生物相容性好，骨髓间充质干细胞可在其表面成活生长，并保持良好旺盛的增殖及理想的成骨诱导效果。复合BMP-2/PDGF-BB后材料保持良好的生物相容性，骨缺损修复效果优于单纯材料植入，有望成为理想的新型骨再生修复替代材料之一。

目录

摘要

前言

第一部分 SD大鼠骨髓间充质干细胞在新型β-磷酸三钙复合材料中的增殖及成骨分化

1．1 引言

1．2 材料

1．3 方法

1．4 结果

1．5 讨论

1．6 结论

第二部分 载骨形态发生蛋白-2／血小板衍生生长因子-BB／β-磷酸三钙复合物用于修复SD大鼠颅骨骨缺损的实验研究

2．1 引言

2．2 材料

2．3 方法

2．4 结果

2．5 讨论

2．6 结论

参考文献

缩略词表

攻读硕士期间成果

致谢

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