阻断Notch和Wnt信号通路对大肠癌生物学行为影响的研究

摘要

大肠癌是消化系统最常见恶性肿瘤之一，目前大肠癌已攀升为恶性肿瘤发病率第3位，且发病率仍将持续上升。目前研究提示，肿瘤（包括大肠癌）发病及进展不同阶段涉及多基因、多种信号转导通路参与。不同信号通路之间存在相互协调、交互作用。
　　在细胞分化过程中负责细胞间信号转导且高度保守的Notch信号通路发生异常及通路下游基因变异将导致肿瘤发生。目前研究表明，Notch信号通路与大肠癌生物特性密切相关，和包括大肠癌在内的多种肿瘤中异常表达，异常增高的Notch-1抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤发展、转移。且Notch信号通路在大肠癌发病中与其他信号通路存在交互作用。大肠癌细胞中异常和脱离控制的信号通路交互作用导致肿瘤形成、并维持干细胞分化、增殖。在大鼠模型中，敲除Tcf4（WNT信号失活）情况下，刺激Notch信号不能引起细胞增殖，表明细胞增殖依赖WNT信号，而在Notch信号抑制情况下，激活WNT通路细胞向腺瘤性分化。上述结果表明，Notch和WNT信号的相互作用在细胞增殖和肿瘤形成中具有重要作用。
　　因此，本课题首先拟证实Wnt信号通路阻断剂rDKK-1及Notch信号通路阻断剂对大肠癌细胞系HCT-116细胞表达是否存在抑制作用，通过抑制其中一条通路的情况下检测另外一条通路表达变化，以阐明是否存在交互作用。并进一步通过分析信号通路阻断剂对细胞周期、增值、侵袭影响阐明信号通路阻断剂作用机制、临床应用前景。课题第三部分进行了移植瘤动物实验以进一步补充验证体外实验研究结果。
　　第一部分:信号通路抑制剂对Notch信号及Wnt信号在HCT-116细胞中表达的抑制作用
　　目的:
　　分析信号通路阻断剂对大肠癌细胞系HCT-116细胞表达抑制效果，并通过阻断其中一条信号通路后检测另外一条信号通路mRNA、蛋白表达水平，了解两条信号通路之间是否存在交互作用。
　　方法:
　　HCT-116细胞分为对照组(DMSO)、Wnt信号阻断组(rDKK-1处理)、Notch信号阻断组（LY374973处理）药物处理48小时后，QRT-PCR检测Notch信号通路相关基因Notch1、Notch2、Hes1、DLL4 mRNA的表达情况及Wnt信号通路相关基因β-catenin、Pra-1、c-myc mRNA的表达情况。采用Western blotting检测信号通路抑制剂对上述7个蛋白表达抑制程度
　　结果:
　　阻断剂LY374973(40nm,48h)、rDKK-1(50nm,48h)、rDKK-1+LY374973处理后，LY374973能导致Notch信号通路相关基因Hes1和DLL4表达下调(P＜0.05)，对Notch1、Notch2表达无影响(P＞0.05)。r-DDK1能引起Wnt通路相关基因β-catenin、C-myc表达下调(P＜0.05)，对Pra-1表达无影响(P＞0.05)。此外r-DDK1除影响自身通路两条基因的表达，还能引起Notch信号通路Hes1和DLL4表达下调(P＜0.05)。Notch通路阻断剂LY374973对Wnt通路相关基因表达无影响(P＞0.05)。共同处理组能引起所检测的7条基因表达下调。Westernblotting结果支持上述QRT-PCR检测结果。
　　结论:
　　信号通路阻断剂能降低Notch及Wnt通路相关基因的表达，阻断Wnt通路后对Notch通路表达存在影响，而阻断Notch信号通路对Wnt信号通路表达无明显影响。
　　第二部分:阻断Notch信号通路及Wnt信号通路对结肠癌细胞系的细胞侵袭、迁移功能，细胞周期及增殖的影响
　　目的:
　　探讨Notch信号通路阻断及Wnt信号阻断对大肠癌细胞系细胞侵袭、迁移功能，细胞周期及增殖的影响及其可能的机制。
　　方法:
　　细胞培养及药物处理同第一部分，采用MTT法检测抑制剂对细胞增殖的影响，PI染色及流式检测细胞周期变化，Transwell体外侵袭实验评估细胞侵袭能力，细胞划痕实验评估药物处理后细胞迁徙能力，细胞免疫荧光检测β-catenin蛋白及Notch1蛋白表达及位置。
　　结果:
　　1.细胞增殖实验:24小时以后r-DKK-1处理组（0.836±0.017），LY374973处理组(0.829±0.032)，较对照DMSO组（1.2166±0.022）比较有显著下降(P＜0.01)，而两种信号通路共同阻滞(r-DDK+ LY374973)后抑制作用更明显(0.444±0.055)。观察至48小时后，两种药物处理细胞与对照组相比仍呈抑制状态。2.细胞周期:rDKK-1或LY374973单独作用48小时后，G0/G1期，S期，细胞的比例没有明显的变化(P＜0.05)，而联合作用(rDKK-1+LY374973)后G0/G1期细胞比例则明显增加（从33.507±2.561％增至61.723±0.766％），P＜0.05差异具有统计学意义。S期三种处理因素和对照组比较均无差异。而G2/M期三种处理细胞比例均明显减少(P＜0.05)。3.Transwell侵袭实验:DMSO组为(76.667±7.5055)个/HP，rDKK-1组为(56.667±5.033)个/HP，差异有统计学意义(P＜0.05)。LY374973组为(47.667±4.163)个/HP，差异有统计学意义(P＜0.05)，rDKK-1+LY374973组为(31.333±2.082)个/HP，差异有统计学意义(P＜0.05)，而rDKK-1和LY374973之间无明显差异(P＞0.05)。3.细胞划痕实验:rDKK-1组作用24小时以后，划痕修复率为(37.309±4.170％)，LY374973组划痕修复率为（38.872±0.937％），rDKK-1+LY374973组划痕修复率为(23.455±0.73823.455±0.738)，差异有统计学意义(P＜0.05)。4.细胞免疫荧光:rDkk-1能明显降低β-catenin蛋白的表达，而LY374973对其表达无影响。LY374973及rDkk-1均未影响Notch1蛋白的表达。
　　结论:
　　信号通路阻滞剂能降低结肠癌细胞系HCT-116细胞增殖、侵袭、迁移能力。
　　第三部分:动物移植瘤模型
　　目的:
　　裸鼠皮下移植瘤模型进一步验证细胞系实验结果及评估信号通路阻滞剂对移植瘤生长的影响
　　方法:
　　建立裸鼠皮下移植瘤模型，成功成瘤后随机分组为:①对照组(注射DMSO);②rDKK-1（5mg/kg，每周给药一次，一共给药3次）处理组;③LY374973（4mg/kg，每周给药一次，一共给药3次）处理组;④rDKK-1+ LY374973处理组。取出肿瘤组织进行，采用第一部分相同QRT-PCR、Western blot检测裸鼠移植瘤中第一部分中基因蛋白表达情况，并于细胞实验相对比。并采用石蜡切片HE染色、石蜡切片免疫组化观察不同蛋白在肿瘤组织中的表达情况。
　　结果:
　　20只裸鼠19只成瘤，成瘤后开始药物治疗观察期12天起，LY474937治疗组和rDKK-1及共同治疗组生长出现明显差别(P＜0.05)。并随着治疗时间推移，逐渐明显。瘤块检测结果提示:与对照组相比，Wnt信号通路阻滞剂rDKK-1未明显影响Wnt通路3条基因表达变化，Notch信号通路阻滞剂LY374973亦未影响Wnt信号通路基因表达变化。两种药物联用时会下调β-catenin、及c-myc表达。Notch信号通路阻滞剂LY374973能下调Notch通路Notch2、Hes1基因表达，对Notch1、DLL4表达无影响。rDKK-1对Notch通路相关基因表达影响同LY374973。两种药物联合处理组能下调Notch2、DLL4、Hes1基因表达。Westernblot检测支持QRT-PCR检测结果。
　　结论:
　　信号通路阻滞剂对裸鼠移植瘤生长具有明显抑制作用，两种药物联合治疗抑制作用更明显，瘤块中mRNA及蛋白表达情况与体外细胞系实验类似但并不完全相同。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 信号通路抑制剂对Notch信号及Wnt信号在HCT-116细胞中表达的抑制作用

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二部分 阻断Notch信号通路及Wnt信号通路对结肠癌细胞系的细胞侵袭、迁移功能，细胞周期及增殖的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分、体外动物实验

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文结论

缩略语中英文对照

攻读博士学位期间成果

致谢

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