VEGF125-136小肽标记CY5.5及钆剂体内外靶向荧光及MRI实验研究

摘要

目的：
　　一、实验组VEGF125-136小肽QS及对照组随机小肽QK合成。
　　二、QS及QK小肽活性检测，为进一步荧光及MRI靶向探针制备及靶向成像奠定前期基础。
　　三、cy5.5-QS及cy5.5-QK合成，为下一步靶向荧光成像奠定基础。
　　四、cy5.5-QS及cy5.5-QK体内外荧光成像，观察其对BEL-7402细胞靶向性。
　　五、QS-Gd及QK-Gd合成，为进一步MRI靶向成像奠定基础。
　　六、QS-Gd及QK-Gd体内外MRI成像，观察其对BEL-7402细胞靶向性。
　　方法：
　　一、VEGF125-136小肽QS及随机小肽QK合成
　　固相合成微球小肽QS及QK。
　　二、ELISA法检测QS及QK小肽活性
　　三、cy5.5-QS及cy5.5-QK合成
　　取实验组QS与对照组QK放入固相合成器中标记A与B，氨基脱保护后加CY5.5-NHS、DIPEA反应3小时。TFA切割、乙醚真空沉淀，HPLC纯化、干燥、质谱。
　　四、cy5.5-QS及cy5.5-QK体内外荧光成像
　　1、BEL-7402细胞体外荧光靶向实验
　　(1)免疫荧光成像
　　制备BEL-7402细胞爬片，加入VEGFR-2荧光抗体，DAPI复染细胞核，共聚焦显微镜观察VEGFR-2受体表达情况。
　　(2)细胞荧光实验
　　制备BEL-7402细胞爬片，实验组加CY5.5-QS，对照组加CY5.5-QK，DAPI复染细胞核，共聚焦显微镜观察各组细胞荧光成像异同。
　　2、BEL-7402细胞体内荧光靶向实验
　　(1)荷瘤鼠模型制备
　　(2)活体荧光成像实验
　　实验组注射QS-CY5.5，对照组注射QK-Cy5.5，多时间点采集图像，选感兴趣区测量荧光强度。
　　五、QS-Gd及QK-钆合成
　　QS实验组与QK对照组氨基脱保护后加入DOTA-tris、HBTU、HOBT,DIPEA500ul，350转/分，2小时。FA切割，乙醚沉淀，分别加入乙酸钆82mg，油相内合成，50度，PH始终保持在6.5，24小时。离心收集上清，冻干，HPLC纯化并质谱分析。
　　六、VEGF125-136-Gd体内外MRI成像
　　(1)QS-Gd及QK-Gd体外细胞MRI靶向实验
　　BEL-7402细胞为实验组与对照组，实验组加入递增浓度的QS-Gd，对照组加入等量QK-Gd，37.5℃培养箱内6小时。PBS实验组清洗后各组细胞消化酶各1ml消化1-2分，吸入离心管内，每管1.5ml，加入2％琼脂糖悬浮。3.0MRI扫描，ROI=2mm，测量计算SNR。
　　(2)QS-Gd及QK-Gd体内MRI靶向实验
　　实验尾静脉注射QS-Gd(0.2mmol Gd/kg)，对照组尾静脉注射等量QK-Gd。多时间点扫描，ROI直径约2.0mm，测量计算SNR。
　　(3)BEL-7402HE染色及VEGFR2免疫组化
　　结果：
　　一、VEGF125-136小肽QS及随机小肽QK合成
　　实验组QS小肽分子量为1815.87，对照组QK小肽分子量1689.95，符合理论分子量，合成正确。
　　二、ELISA法检测QS及QK小肽活性
　　QS小肽体外有很强结合VEGFR2受体能力。
　　三、cy5.5-QS及cy5.5-QK合成
　　QS-Cy5.5经质谱仪分析分子量2193.16，QK-Cy5.5经质谱仪分析分子量2067.94，合成正确。
　　四、cy5.5-QS及cy5.5-QK体内外荧光成像
　　1.免疫荧光实验
　　实验显示BEL-7402细胞膜有较多绿色荧光物质FITC-VEGFR2抗体。
　　2.细胞荧光实验
　　CY5.5-QS实验组BEL-7402细胞膜膜及细胞核细胞膜融合图像可见大量靶向红色荧光物质CY5.5-QS;CY5.5-QK对照组未见明显红色荧光标记。
　　3.体内荧光实验
　　实验组尾静脉给药CY5.5-QS，荧光信号迅速上升，5分钟达第一峰值后开始下降，60分钟信号再次上升，2小时信号达最大值，为第二靶向峰值，然后再次下降，4小时接近平扫。对照组尾静脉给药CY5.5-QK，荧光信号迅速上升，5分钟达峰值，后迅速下降，未见信号再次上升。
　　五、VEGF125-136-Gd及随机小肽-钆合成
　　实验组QS-Gd经质谱仪分析分子量为2133.795，驰预率1/T1=7.79mM-1s-1。对照组QK-Gd经质谱仪分析分子量为2264.348，驰预率1/T1=7.46mM-1s-1.
　　六、QS-Gd及QK-Gd体内外MRI成像
　　1.QS-Gd及QK-Gd体外细胞MRI靶向实验
　　QS-Gd实验组强化明显高于对照组QK-Gd，且随加入靶向钆剂增多强化增强，对照组QK-Gd未见明显强化。
　　2.QS-Gd及QK-Gd体内MRI靶向实验
　　实验组尾静脉给药QS-Gd(0.2mmol Gd/kg)，T1信号迅速上升，5分钟达第一峰值后开始下降，60分钟信号再次上升，2小时信号大最大值，然后再次下降，4小时接近平扫。对照组尾静脉给药QK-Gd，T1信号迅速上升，5分钟达峰值，后迅速下降，未见信号再次上升。
　　3.免疫组化实验
　　BEL-7402细胞膜表面有丰富的VEGFR2受体表达。
　　结论：
　　1.成功合成实验组QS小肽及对照组QK小肽。
　　2.QS小肽体外有很强结合VEGFR2受体活性。
　　3.成功合成cy5.5-QS及cy5.5-QK，cy5.5-QS纯度为99.65％，cy5.5-QK纯度为70.25％。
　　4.免疫荧光实验表明BEL-7402细胞膜VEGFR2受体阳性。体内外细胞荧光实验显示cy5.5-QS可以BEL-7402细胞膜VEGFR2受体为靶点靶向荧光成像。
　　5.成功构建QS-Gd及QK-Gd，对比剂理化性质符合体内外T1增强需要。
　　6.BEL-7402腋下肿瘤模型制作成功。体内外MRI实验表明QS-Gd可以BEL-7402细胞膜VEGFR2受体为靶点靶向MRI成像。

目录

摘要

1．1 前言

1．2 VEGF165与受体VEGFR2

1．3 基于VEGFR2靶点的高亲和力多肽的筛选及鉴定

1．4 光学成像

1．5 磁共振成像及MR检查技术

1．6 多模态成像

1．7 MRI靶向对比剂研究现状

1．8 本课题研究路线

实验技术路线

第2章 VEGF125-136小肽及随机小肽合成

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

本章小结

第3章 VEGF125-136小肽及随机小肽活性检测

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

本章小结

第4章 cy5．5-VEGF125-136小肽及随机小肽合成

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

本章小结

第5章 cy5．5-VEGF125-136小肽及随机小肽体内外靶向实验

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．3 结果

5．4 讨论

本章小结

第6章 VEGF125-136-Gd及随机小肽-钆合成

6．1 前言

6．2 材料与方法

6．3 结果

6．4 讨论

本章小结

第7章 VEGF125-136-Gd体内外靶向实验

7．1 前言

7．2 材料与方法

7．3 结果

7．4 讨论

本章小结

参考文献

攻读学位期间成果

论文说明

略词中英文对照表

致谢

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