长链非编码RNA linc-UBC1在结直肠癌中的表达及其功能研究

摘要

目的:
　　现已有大量的研究证明了长链非编码RNA(1ncRNA)对恶性肿瘤发生发展的调控作用。据研究报道长链非编码RNA linc-UBC1可通过结合PRC2而影响膀胱癌预后。本研究拟通过检测linc-UBC1在结直肠癌(CRC)中的表达，探索linc-UBC1对CRC细胞生物学功能的影响，初步揭示linc-UBC1对CRC的作用，为今后CRC的诊断和治疗提供新的思路。
　　方法:
　　1.收集96例结直肠癌患者的手术标本（包含癌组织和对应癌旁组织）和患者的临床病理资料，结直肠癌细胞系（SW480、SW620、HCT116和HT29）以及正常结肠上皮细胞NCM460由南方医科大学捐赠。
　　2.通过实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)检测结直肠癌组织和对应癌旁组织linc-UBC1的表达量，并分析其与临床病理资料的关系，采用Kaplan—Meier法分析linc-UBC1与生存资料的关系。
　　3.通过RT-qPCR检测4种结直肠癌细胞系及正常结肠上皮细胞NCM460中linc-UBC1的表达量，选取linc-UBC1表达量最高的结直肠癌细胞系SW620，通过脂质体转染技术干扰SW620细胞系中的linc-UBC1基因，并使用RT-qPCR检测其干扰效率。
　　4.运用CCK8、流式细胞术及Transwell实验检测linc-UBC1基因干扰后的SW620细胞系的增殖能力、凋亡率及周期、迁移及侵袭能力的变化。
　　5.运用western blot实验检测linc-UBC1基因干扰后的SW620细胞系的凋亡相关蛋白（cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bcl-2）表达量的变化。
　　结果:
　　1.linc-UBC1在结直肠癌组织中的相对表达量为6.55±6.60，远高于癌旁组织的相对表达量1.67±1.54，两者比较差异有统计学意义(t=8.32，P＜0.001)。
　　2.通过分析linc-UBC1的表达量与临床病理的关系得出:linc-UBC1的表达量与结直肠癌的TNM分期、肿瘤的大小、浸润的深度及淋巴结转移相关;差异有统计学意义（P＜0.05）。而与患者的性别、年龄、肿瘤的分化程度、肿瘤位置和远处转移无关(P＞0.05)。生存分析结果显示:linc-UBC1高表达组的生存时间明显小于linc-UBC1低表达组，差异有统计学意义(P＜0.01)。多因素COX回归分析表明:linc-UBC1的表达水平可作为CRC患者的独立预后因子(Hazard ratio:2.434,95％CI:1.093-5.420,P=0.029)。
　　3.与NCM460相比，SW620、HCT116和HT29中linc-UBC1表达水平均明显升高(P＜0.01)，而在SW480细胞中无显著差异（P＞0.05），其中SW620的linc-UBC1表达量最高。
　　4.与阴性对照组相比，linc-UBC1干扰组的SW620的增殖、迁移及侵袭能力降低，凋亡率升高及周期受到抑制(P＜0.05)。
　　5.与阴性对照组相比，linc-UBC1干扰组的SW620的凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达量显著上升，Bcl-2的表达量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:
　　linc-UBC1在CRC组织中的表达量显著升高，且linc-UBC1的表达量与CRC的TNM分期、肿瘤的大小、浸润的深度、淋巴结转移及不良预后正相关，并且linc-UBC1可以促进CRC细胞的增殖、迁移及侵袭。因此，linc-UBC1有可能成为判断CRC患者预后和发展的新的肿瘤标记物。

目录

摘要

1．1 结直肠癌概述

1．2 lncRNA的研究现状

1．3 linc-UBC1的简介

1．4 整体研究思路

2．1 材料

2．1．1 结直肠癌组织标本来源

2．1．2 结直肠癌细胞系来源

2．2 主要试剂、材料及仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要实验材料和仪器

2．2．3 主要试剂的配制

2．2．4 RT-qPCR引物及si-RNA序列

2．3 实验方法

2．3．1 RNA提取及检测

2．3．2 RNA反转录反应

2．3．3 RT-qPCR扩增cDNA

2．3．4 细胞培养

2．3．5 细胞转染

2．3．6 CCK-8实验检测细胞增殖能力

2．3．7 流式细胞仪检测细胞凋亡及周期

2．3．8 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力

2．3．9 Western Blot实验方法

2．4 统计方法

第3章 长链非编码RNA linc-UBC1在结直肠癌中的表达及其临床意义

3．1 结果

3．1．1 linc-UBC1在结直肠癌中的表达情况及其与临床病理特征的关系

3．1．2 linc-UBC1的表达量与临床预后的关系

3．2 讨论

3．3 结论

第4章 长链非编码RNA linc-UBC1对结直肠癌细胞生物学功能的影响

4．1 结果

4．1．2 检测linc-UBC1的干扰效果

4．1．3 linc-UBC1对结直肠癌细胞系增殖能力的影响

4．1．4 流式细胞术检测细胞的凋亡及周期

4．1．5 western blot检测凋亡相关蛋白

4．1．6 linc-UBC1对结直肠癌细胞系迁移及侵袭能力的影响

4．2 讨论

4．3 结论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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