转化生长因子β1-结缔组织生长因子(TGF-β1/CTGF)信号轴介导胶质瘤替莫唑胺化疗耐药机制研究

摘要

胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GB)为颅内最常见原发性恶性肿瘤，尽管目前以手术联合放化疗的综合治疗方法已成为指南，但GB患者预后仍未改善，术后极易复发。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是目前GB治疗一线化疗药，但TMZ耐药是制约胶质瘤化疗疗效并导致治疗失败的重要原因。
　　既往研究显示结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)差异表达与肿瘤耐药存在相关性，然而其在胶质瘤TMZ耐药中具体调控机制尚不明确。本研究拟深入探讨CTGF介导的胶质瘤TMZ耐药调控网络，以期丰富胶质瘤耐药分子调控机制，为胶质瘤TMZ耐药机制阐明及临床逆转提供依据。
　　目的：
　　明确CTGF在胶质瘤TMZ耐药进程中所扮演的角色;证实CTGF可通过干性获取调制胶质瘤细胞TMZ耐药;并深入阐明TGF-β信号激活促进CTGF表达介导胶质瘤TMZ耐药的分子调控机制。
　　方法：
　　采用免疫组化、qRT-PCR等分析CTGF表达与胶质瘤耐药的相关性;应用慢病毒干扰或过表达等功能性研究CTGF表达对胶质瘤TMZ耐药的影响;通过肿瘤球形成、流式细胞术等探讨CTGF与肿瘤干性表达的相关性;运用ELISA、Western blot等深入阐明TGF-β信号激活促进CTGF表达介导胶质瘤TMZ耐药分子机制。
　　结果：
　　1)药物敏感性分析发现，体外构建的胶质瘤TMZ耐药细胞IC50在1.5-2.0mM间，其耐药性显著高于亲本细胞(1.0mM);qRT-PCR、Western blot检测提示，胶质瘤TMZ耐药细胞显著高表达ABCB1、ABCC、BCRP及MGMT耐药相关表型基因与蛋白。
　　2)耐药细胞基因芯片分析与筛选发现，CTGF在胶质瘤TMZ耐药细胞中差异高表达（上调9.14倍）;临床胶质瘤组织样本检测证实CTGF表达与胶质瘤恶性分级、肿瘤耐药性呈正相关关系。
　　3)TMZ处理促进体外胶质瘤细胞CTGF mRNA与蛋白表达，且具有明显的时间与浓度依赖。
　　4)干扰CTGF抑制胶质瘤细胞克隆形成能力，提高胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性，增强TMZ诱导的细胞凋亡蛋白C-PARP表达;裸鼠皮下成瘤实验发现干扰CTGF抑制体内胶质瘤的生长及肿瘤形成。
　　5)过表达CTGF增强并回复TMZ预处理后胶质瘤细胞克隆形成能力，下调胶质瘤细胞对TMZ化疗敏感性，并降低TMZ凋亡诱导;过表达CTGF促进裸鼠皮下成瘤，下调C-PARP表达，增强胶质瘤对TMZ化疗耐药。
　　6)CTGF上调胶质瘤细胞肿瘤干性基因ALDH1、CD44、Nestin、Nanog的表达，增强胶质瘤细胞肿瘤球形成能力，促进CD44+细胞表达与蛋白表达;siCD44共转染分析发现，干扰CD44抑制过表达CTGF胶质瘤细胞肿瘤球形成能力，逆转CTGF介导的胶质瘤TMZ耐药性。
　　7)ELISA与qRT-PCR检测结果显示TMZ促进胶质瘤细胞TGF-β1表达上调，且具有一定的浓度依赖;免疫荧光提示TGF-β1与CTGF存在共表达关系;联合TGF-β中和抗体或抑制剂SB431542逆转TMZ诱导的CTGF表达上调，而加入rTGF-β1因子促进胶质瘤细胞CTGF蛋白表达。
　　8)TMZ促进胶质瘤细胞Smad3与ERK1/2蛋白磷酸化;瞬时干扰Smad3与ERK1/2下调胶质瘤细胞CTGF蛋白表达，同时逆转过表达CTGF引起的TMZ耐药;裸鼠皮下成瘤实验证实胶质瘤化疗过程中TMZ促进胶质瘤耐药性产生，且与TGF-β1-Smad3/ERK1/2-CTGF信号通路激活密切相关。
　　结论：
　　1)耐药细胞模型与临床组织样本证实CTGF与胶质瘤耐药密切相关。
　　2)体外TMZ处理促进胶质瘤细胞CTGF表达;下调胶质瘤细胞CTGF表达促进TMZ化疗增敏与细胞凋亡;而过表达CTGF促进胶质瘤TMZ化疗耐药，细胞凋亡调制参与了这一过程。
　　3)CTGF促进胶质瘤细胞肿瘤干性表达，靶向肿瘤干性调制CTGF介导的胶质瘤TMZ耐药性改变。
　　4)TGF-β1信号激活促进TMZ诱导的CTGF表达上调，Smad与ERK信号参与TMZ诱导的TGF-β1/CTGF信号轴在胶质瘤TMZ耐药中的激活。

目录

摘要

前言

第一章 CTGF与胶质瘤替莫唑胺耐药相关性分析

1．1 材料和方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 结论

第二章 CTGF促进胶质瘤替莫唑胺化疗耐药

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 结论

第三章 CTGF通过干性获取调制胶质瘤替莫唑胺耐药

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 结论

第四章 TGF-β1依赖Smad／ERK信号激活参与介导CTGF表达调控胶质瘤替莫唑胺耐药

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 结论

全文小结

参考文献

综述 胶质瘤耐药相关机制研究进展

中英文对照缩略词表

博士学位期间学术成果

致谢

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