秀丽隐杆线虫感染模型中不同耐药表型的肺炎克雷伯菌的毒力分析

摘要

目的:
　　利用一种新的实验方法——固体培养法,建立秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型;利用该模型比较不同耐药表型的肺炎克雷伯菌致病能力的差异;分析其毒力机制并进一步探讨耐药性与毒力间的联系。
　　方法:
　　2.1 线虫同期化处理
　　将孕虫收集至离心管内,洗涤、离心,弃上清液,保留3.5mL液体;加入1.5mL线虫裂解液,剧烈震荡至虫体全部裂解;将收集的虫卵用M9缓冲液洗涤3次;20℃过夜培养,获得L1期线虫;将L1期线虫转移至NGM-OP50培养板,20℃培养48h至L4期。
　　2.2 感染平板的制备
　　将复苏、培养后的待测菌液稀释至105cfu/mL,取10uL菌悬液滴加于SK琼脂平板上,涂布均匀;室温干燥后,37℃静置培养8h,冷却至室温备用。
　　2.3 线虫致死实验
　　转接线虫前,在每块感染平板上滴加一定浓度的FUDR,抑制野生型线虫生长繁殖;每块感染平板上转接10条L4期线虫。以大肠埃希菌OP50喂养的线虫作为实验对照组。25℃培养,每24h观察一次线虫的活动状态,并记录线虫生存状态,当线虫无摇头、咀嚼等动作,并呈刚性直线时,判定为死亡。
　　2.4 不同耐药表型的肺炎克雷伯菌致病能力比较
　　根据体外药敏结果,将实验组分为：敏感组、多重耐药组、碳青酶烯类耐药组。取不同耐药表型的肺炎克雷伯菌分别感染线虫（10条/皿）,每株细菌至少准备3个样本。以大肠埃希菌OP50喂养的线虫作为对照组。25℃培养,每天记录线虫存活状态。
　　2.5 线虫体内细菌计数及鉴定
　　在固定时间点,取肺炎克雷伯菌感染后的线虫;叠氮化钠清洗3次后,挑取5条线虫加入含有无菌的PBS溶液及石英砂的EP管内,震荡离心,使虫体裂解,释放细菌;取上清液进行细菌纯培养,并进行细菌菌种鉴定及药敏测试。
　　2.6 肺炎克雷伯菌毒力因子检测
　　所有细菌进行拉丝实验,并采用PCR技术进行目标基因（包括荚膜血清型及毒力基因）检测。
　　2.7 统计分析
　　以上实验均重复3次,采用IBM SPSS Statitics19.0软件进行统计分析。Kaplan-Meier方法进行生存分析,Log-rank检验法对组间数据进行差异显著性分析。完全随机设计资料采用单因素方差分析进行均数比较。P＜0.05为差异明显。
　　结果:
　　3.1 秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型建立
　　结果显示,实验组较对照组,线虫致死现象明显。实验组与对照组线虫LT50(d)分别为8.000±0.769,11.000±0.458,二者生存曲线存在差异(x2=27.519,P＜0.05)。肺炎克雷伯菌感染24h、48h、72h后,线虫体内细菌数量分别为1.949×104cfu/mL、0.911×105cfu/mL、1.523×106cfu/mL,不同时间点感染线虫体内细菌数量有统计学差异(F=37.192,P＜0.001)。经LSD检验显示,各时间点间线虫体内细菌数量均有统计学差异(P＜0.05)。线虫体内细菌菌种鉴定及药敏结果与初始感染细菌一致。说明在实验时间范围内,肺炎克雷伯菌能在线虫体内定植、繁殖,并最终导致线虫死亡。
　　3.2 不同耐药表型肺炎克雷伯菌致病能力比较
　　结果显示,对照组（大肠埃希菌OP50组）线虫LT50(d)为11.000±0.458,而敏感组、多重耐药组（MDRKP）、碳青霉烯类耐药组(CRKP)的LT50(d)分别为10.000±0.231、9.000±0.080、9.000±0.130。三组致死时间(d)分别为5.500、3.860、3.560,三组间致死时间具有统计学差异(F=5.610,P＜0.05),其中,敏感菌组与多重耐药组（MDRKP）、敏感组与碳青霉烯类耐药组(CRKP),致死时间均存在统计学差异(P＜0.05),多重耐药组与碳青霉烯类耐药组致死时间无统计学差异（P=0.498）。72h后,三组线虫体内细菌计数（106cfu/mL）分别为1.478±0.861、1.622±0.524、1.467±0.739,各组间无统计学差异（F=0.137,P=0.872）。
　　3.3 肺炎克雷伯菌毒力因子检测
　　10株临床分离的肺炎克雷伯菌中,除敏感菌株KP3拉丝实验及rmpA基因检测阳性外,其余菌株拉丝试验及毒力基因检测均阴性。
　　结论:
　　4.1 在国内首次采用利用一种新的实验方法——固体培养法,建立秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型。
　　4.2 耐药型菌株较敏感型菌株致病能力稍强,可在线虫体内长期定植、繁殖,导致秀丽隐杆线虫在更短的时间内死亡。
　　4.3 本实验检测范围内,耐药型菌株内并未发现导致毒力增强的相关毒力因子,提示可能存在其他机制导致毒力增强。

目录

摘要

前言

一、耐药现状及耐药机制

二、毒力机制

三、耐药性与毒力关系的研究进展

四、秀丽隐杆线虫在感染模型中的应用

五、研究目的及意义

第一部分 秀丽隐杆线虫-肺炎克雷伯菌感染模型的建立

1 实验材料

2 方法

3结果

4讨论

第二部分 不同耐药表型肺炎克雷伯菌致病能力比较

1实验材料

2实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 不同耐药表型的肺炎克雷伯菌毒力因子检测

1实验材料

2实验方法

3 结果

4 讨论

结论和展望

参考文献

中英文对照缩略词

硕士期间发表论文

致谢

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