双功能化核酸适体介导的催化茎环自组装技术检测肿瘤细胞的方法学研究

摘要

目的：
　　在肿瘤的发生、发展过程中，肿瘤细胞能从实体瘤中脱落并进入外周血、胸水等体液标本中。研究表明，这些肿瘤细胞在肿瘤转移过程中扮演着重要角色，其数量对早期发现肿瘤微转移、疗效监测、耐药性判断、预后判断和肿瘤的个体化治疗具有重要意义。且肿瘤细胞检测相对于传统的肿瘤诊断方法具有无创、方便、可反复取样、易于实时监控等优势。因此，建立一种快速、准确、简便的肿瘤细胞检测方法具有广泛应用前景。
　　传统的肿瘤细胞检测方法主要有免疫细胞化学技术、流式细胞术、逆转录聚合酶链式反应和二代测序等。这几种方法各具特点，并不同程度的解决了肿瘤细胞检测的相关问题，但仍存在操作复杂、检测周期长、价格昂贵等不足。近年来备受关注的用于循环肿瘤细胞检测的Cellsearch(R)被看作是CTCs检测的金标准，该方法为肿瘤细胞检测提供了新平台，但仍存在标志物种类局限、假阴性率高和设备昂贵等不足。同时，越来越多的新兴技术和新型纳米材料被用于开发肿瘤细胞检测新方法，这些方法可针对肿瘤细胞不同标志物进行检测，但仍受限于方法性能而未能在临床上得到推广。其中，核酸适体具有其他适配体无法比拟的高特异性、易于合成及保存等优点，DNA纳米技术通过简单核酸反应即可高效放大信号。
　　基于此，我们充分利用核酸适体特异性识别肿瘤细胞及核酸本质的特点，结合茎环催化自组装反应的指数信号放大的优点，对核酸适体延长以使其双功能化——特异性识别靶细胞、特异性触发茎环催化自组装信号放大反应，并采用荧光信号分析，建立一种简便、快速、灵敏、特异的肿瘤细胞检测方法，为临床体液标本中肿瘤细胞检测提供新的思路和实验基础。
　　方法：
　　1.催化茎环自组装体系的构建
　　1.1 设计并合成参与反应的寡核苷酸链，并通过NUPACK软件对反应底物——两茎环结构探针的各类物理参数进行计算和评估。
　　1.2 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对催化茎环自组装体系的反应产物进行分析，验证反应底物的稳定性及反应效果。
　　1.3 采用荧光基团修饰的寡核苷酸链进行反应，观察催化茎环自组装反应的荧光响应情况，进一步验证该反应体系的可行性。
　　2.肿瘤细胞检测体系的性能评价及实际应用能力评估
　　2.1 制备不同数量的靶细胞悬液，使用所提出的肿瘤细胞检测思路，分别对各实验组进行反应终点的荧光光谱分析及实时监测荧光信号，以验证该方法的可行性。
　　2.2 观察不同的反应温度、反应时间对反应的影响，选择反应的最佳环境。
　　2.3 在最佳反应条件下，用所构建的方法对系列浓度的靶肿瘤细胞进行检测，分析得出该方法的线性检测范围和检测限，评价其检测灵敏度。
　　2.4 在所构建的反应体系中，分别对靶肿瘤细胞、正常体细胞、白细胞、靶肿瘤细胞与正常体细胞混合液、靶肿瘤细胞与白细胞混合液进行检测，比较并分析各组结果，以评价该方法的检测特异性。
　　2.5 收集血清、尿液、脑脊液和胸水等体液标本，均掺入三种数量水平的靶肿瘤细胞，并用所建立方法进行检测，以评估该方法的临床应用价值。
　　结果：
　　1.催化茎环自组装反应经理论分析、电泳表征和荧光信号分析，均得出一致结果：寡核苷酸链底物的二级茎环结构稳定，反应特异，并在短时间内顺利实现高效信号放大，适用于后续肿瘤细胞检测新方法的构建。
　　2.所建立的方法能特异性识别肿瘤细胞并产生相应信号，最佳反应条件(37℃，45min)下，其线性检测范围为10～103细胞/毫升，数学定量模型为F=74.47+7.399log10C，R2为0.9791，检测限达到10细胞/毫升。该方法很好地区别肿瘤细胞与干扰细胞（包括正常体细胞和白细胞），且有效地从干扰细胞中区分肿瘤细胞;其对多种体液标本中不同数量肿瘤细胞分析结果与缓冲液中结果相近。同时，采用不同适体、反应序列和荧光基团建立的新体系仍实现肿瘤细胞检测。
　　结论：
　　本研究基于高效放大信号的催化茎环自组装及特异识别靶标的核酸适配体，建立了一种简便、灵敏、特异、高效、经济的肿瘤细胞检测新方法。该方法检测灵敏度可达到10细胞/毫升，有效排除干扰细胞对肿瘤细胞检测的影响，适用于多种临床标本的检测，在液体活检、个体化医疗等领域实现快速筛查具有潜在应用价值。

目录

摘要

前言

一、肿瘤细胞的研究意义

二、肿瘤细胞检测方法的国内外研究现状和进展

三、核酸适体技术的研究与应用

四、催化茎环自缈睫技术的研究与应用

五、本文研究内容

参考文献

第一部分 催化茎环自组装体系的可行性探讨

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

第二部分 肿瘤细胞检测体系的性能评价及实际应用能力计评1估白

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

参考文献

全文总结

攻读学位期间成果

致谢

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