抑制let--7i上调CCND2及E2F2促进心肌细胞再生及损伤后心脏功能恢复的研究

摘要

目的： 冠状动脉闭塞由病变血管粥样斑块内或内膜下出血、管腔内血栓形成或动脉持久性痉挛，使管腔发生完全或不完全的闭塞，导致心脏灌注不足，使得心脏组织的缺血，可破坏心肌细胞而引起的心肌梗死。心肌细胞对于维持心脏功能是至关重要的。成熟的心肌细胞处于终末分化状态，永久性地退出细胞周期，几乎没有再生能力，无法实现心肌损伤后的自我修复。哺乳动物心脏损伤发生后主要反应是心肌纤维化、非收缩性疤痕组织的形成，使心脏功能受损，最终导致心衰发生。因此，促进退出细胞周期的心肌细胞再次进入细胞周期，补充丢失的心肌细胞，是实现心肌再生的关键(1)。在胚胎早期，小鼠心肌细胞的增殖水平很高，从胚胎第10-12天附近细胞增殖水平开始下降。出生后第2周，许多心肌细胞发生“细胞质不分裂”有丝分裂，产生双核心肌细胞。之后大多数心肌细胞处于细胞周期停滞状态(2，3)。近年在成年哺乳动物的心脏中发现存在心肌细胞增殖现象(4)。然而，心肌细胞增殖能力极其有限，且远不足以恢复损伤后的心脏功能(5，6)。目前有关出生后阶段如何发生不可逆的细胞周期停滞机制尚不清楚。因此，通过分析新生及成年心肌细胞的细胞周期活性之间的差异，了解心肌细胞周期的基本机制，将有助于促进心肌细胞大量增殖，恢复缺血性心血管疾病引起的心脏功能损害。 MicroRNAs（miRNAs）是一类约含22个核苷酸的单链小分子RNA，(7)。miRNAs通过与靶向mRNAs的3-非编码(3'UTR)靶向识别结合，诱导的目标mRNAs沉默，在转录后水平发挥调节基因表达的作用。研究发现，miRNAs可参与心脏的发育及功能的完善，对心肌细胞增殖和成熟有着关键作用(7-9)。既往体外实验验证，let-7i具有强烈抑制心肌细胞增殖的功能。然而，它是否在体内对心肌细胞发挥相同功能及具体作用机制尚不清楚。 我们通过生物信息学技术，预测到CCND2、E2F2是let-7i的潜在的靶基因。CCND2、E2F2是细胞周期调节因子，其异常表达可致细胞增殖异常。因此我们猜测let-7i通过调节细胞周期，调控心肌细胞增殖。在本研究中，我们将通过在体内过表达/敲低let-7i的表达量并在成年小鼠心梗模型上进行验证。 方法： 1.新生1天龄、7天龄和10天龄乳鼠心肌细胞let-7i表达量的差异分析 A.体外分离及培养出生后1天、7天以及10天的乳鼠心室心肌细胞。 B.实时定量PCR验证let-7i差异性表达于不同鼠龄的心肌细胞。 2.探索在新生1天乳鼠小鼠体内过表达let-7i是否抑制心肌细胞增殖。 A.新生1天乳鼠小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒(Ad-let-7i/Ad-NC)，过表达let-7i表达量，免疫荧光标记增殖核抗原(EdU，pH3)检测心肌细胞增殖的情况。 B.新生1天乳鼠小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒（Ad-let-7i/Ad-NC），过表达let-7i表达量，免疫荧光标记细胞边界(WGA)，检测敲低let-7i是否对心肌细胞的肥厚产生影响。 3.探索在成年小鼠体内敲低let-7i是否促进心肌细胞增殖。 A.成年小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒（AAV-anti-let-7i/AAV-NC），敲低let-7i表达量，免疫荧光标记增殖核抗原(EdU，pH3)检测心肌细胞增殖的情况。 B.成年小鼠左心室心肌内注射腺相关病毒（AAV-anti-let-7i/AAV-NC），敲低let-7i表达量，免疫荧光标记细胞边界(WGA)，检测敲低let-7i是否促进心肌细胞的肥厚。 4.探索敲低let-7i是否促进心肌梗死后心肌再生及改善心功能。 A.制备成年小鼠心梗模型，心肌梗死边缘区局部注射AAV-anti-let-7i/AAV-NC，免疫荧光标记细胞增殖核抗原检测(EdU，pH3)梗死周边区心肌细胞增殖，免疫荧光标记细胞膜检测(WGA)梗死周边区心肌细胞直径变化; B.M型超声观察心功能变化及masson染色观察心肌纤维化程度。 5.探索let-7i调控心肌再生的分子机制。 A.生物信息学预测let-7i可能结合的mRNA; B.荧光素酶基因报告系统、免疫荧光素酶及蛋白免疫印迹试验验证。 结果： 1.let-7i的表达量随着鼠龄的增加而增加。 2.在体内过表达let-7i表达抑制心肌细胞增殖，抑制let-7i表达可以促进心肌细胞增殖。 3.在体内抑制let-7i的表达后，可以促进心肌梗死后的心脏功能的恢复。 4.let-7i作用于CCND2、E2F2，调节心肌细胞细胞周期，调控心肌细胞增生。 结论： let-7i靶向作用于CCND2、E2F2，调节心肌细胞细胞周期，调控心肌细胞增生，影响心肌梗死后心脏功能恢复。

目录

摘要

前言

第一部分不同年龄的小鼠心脏let-7i表达量的差异分析

前言

材料与方法

1．实验动物

2．主要的实验试剂

3．主要设备

4．RNA分离和实时荧光定量PCR

结果

讨论

第二部分体内抑制let-7i的表达促进心肌细胞增殖，改善心肌梗死后心脏功能的恢复

前言

材料与方法

1．实验动物

2．主要实验试剂

3．主要设备

4．实验方法

实验结果

讨论

第三部分let-7i通过调控CCND2、E2F2影响心肌细胞细胞周期，调控心肌细胞的增殖

前言

材料与方法

1．实验动物

2．主要实验试剂

3．主要设备

5．统计学分析

结果

讨论

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

声明