清除Treg细胞提高Sa-mGM-CSF前列腺癌细胞疫苗的抗肿瘤效果

摘要

前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤之一，早期局限性前列腺癌一般采用手术或局部放疗，而晚期多采用内分泌治疗，但随着时间的延长，很多患者发展为去势抵抗性前列腺癌。
　　免疫治疗（疫苗或细胞因子）是治疗肿瘤的有效途径之一。本实验将链亲和素标记的mGM-CSF(SA-mGM-CSF)锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，成功制备一种新型肿瘤细胞疫苗。研究表明该疫苗具有较好的疗效，但疫苗治疗后肿瘤微环境中的Treg细胞也明显增加。Treg细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，参与肿瘤免疫逃逸。因此，抑制或清除Treg细胞必将有效提高抗肿瘤免疫反应。近期研究发现，ICOS+Treg是发挥免疫抑制作用的主要Treg亚群。前期的研究发现，体外活化ICOS信号可显著促进Treg细胞的增殖和免疫抑制功能。基于以上研究结果，提出设想：采用ICOS封闭性抗体靶向清除Treg细胞，从而提高疫苗的疗效。
　　去甲斑蝥素(NCTD)具有很强的抗肿瘤能力，能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。NCTD具有区别于普通化疗药物的最显著特点，即NCTD具有升白作用，可减少化疗后的骨髓抑制。近期有报道称，NCTD还具有免疫调控作用，但对Treg细胞的影响报道罕见。
　　研究目的：
　　1.探究ICOS封闭性抗体是否可以靶向清除Treg细胞，提高SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的疗效。
　　2.探究NCTD对Treg细胞增殖和凋亡的影响，以及NCTD联合SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗治疗小鼠前列腺癌的疗效。
　　研究方法：
　　ICOS封闭性抗体联合SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗治疗前列腺癌：C57BL/6雄鼠的右后腿腹股沟区皮下注射RM-1前列腺癌细胞，建立皮下前列腺癌模型，随后观察成瘤效果并记录肿瘤大小。随机将小鼠分为四组(PBS，Vaccine，Vaccine+IgG mAb和Vaccine+ICOS mAb组)，于肿瘤细胞接种后的第12天开始，每隔4天皮下注射一次疫苗，共4次，每隔3天腹腔注射ICOS封闭性抗体100μg，共4次。治疗结束后一周，流式细胞术检测血液中成熟的DC细胞，CD4+、CD8+T淋巴细胞以及ICOS+Treg细胞的含量;免疫组化检测肿瘤微环境中的CD4+、CD8+T淋巴细胞;免疫荧光检测肿瘤组织中的ICOS+Treg细胞以及ELISA检测小鼠血清中的IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。
　　NCTD对Treg细胞增殖和凋亡的影响：采用磁珠分选技术获取Treg细胞。活化性的CD3和CD28抗体刺激细胞，并加入不同浓度(0-80μM)的NCTD作用24h或者20μM NCTD作用0-3天。收集各时间点的细胞，CCK8检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。提取20μM NCTD处理后的Treg细胞总蛋白和总RNA，western blot和Real Time PCR分别检测凋亡相关蛋白的蛋白水平和基因水平。
　　NCTD联合SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗治疗小鼠前列腺癌：同上述方法建立动物模型。随机分为四组(PBS，NCTD，Vaccine和Vaccine+NCTD组)，于肿瘤细胞接种后的第10天开始，同上方法进行疫苗治疗，同时腹腔注射NCTD10mg/kg/天，连续14天。治疗结束后同上述方法检测DC细胞，CD4+T、CD8+T淋巴细胞以及Treg细胞的含量。
　　研究结果：
　　1.ICOS抗体显著提高SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应。
　　与PBS对照组相比，肿瘤疫苗能有效抑制肿瘤生长，小鼠血液和肿瘤组织中的CD4+、CD8+T淋巴细胞明显增多，但肿瘤组织中ICOS+Treg细胞也明显增多。联合ICOS抗体治疗后，肿瘤体积缩减更快，ICOS+Treg细胞明显减少，血液和肿瘤组织中效应T细胞增加更显著，血清中IL-4和IL-10含量显著降低。
　　2.NCTD体外对Treg细胞的影响。
　　NCTD显著抑制Treg细胞增殖并诱导凋亡，且呈时间、剂量依赖关系。机制研究发现，NCTD能明显下调p-AKT，从而上调FOXO1、FasL蛋白。Fas、FasL、FOXO3a、FOXO4和FOXO1基因表达水平也明显升高。
　　3.NCTD显著提高SA-mGM-CSF肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应。
　　与PBS对照组相比，疫苗或NCTD单独治疗能有效抑制肿瘤生长，小鼠血液和肿瘤组织中的CD4+、CD8+T淋巴细胞。疫苗治疗后Treg细胞明显增多，而NCTD能减少Treg细胞。联合NCTD治疗后，肿瘤体积缩减更快，Treg细胞明显减少，血液和肿瘤组织中的效应T细胞增加更显著。
　　研究结论：
　　1.ICOS封闭性抗体可以通过清除ICOS+Treg细胞，显著提高SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的抗肿瘤效果。
　　2.NCTD体外能抑制Treg细胞增殖且诱导凋亡，以及NCTD体内能明显减少SA-mGM-CSF膜修饰前列腺癌细胞疫苗诱导的Treg细胞，显著增强其疗效。

目录

摘要

前言

第一章 疫苗的制备

1．1 实验材料与方法

1．1．2 主要实验试剂和仪器

1．1．3 主要试剂的配置

1．2 实验方法

1．2．1 RM-1细胞培养

1．2．2 细胞传代

1．2．3 细胞冻存

1．2．4 细胞计数及细胞活性检测

1．2．5 SA-mGM-CSF膜修饰RM-1前列腺癌细胞疫苗的制备

1．2．6 检测肿瘤细胞疫苗的锚定率

1．3 实验结果

1．3．1 流式分析结果

1．4 讨论

1．5 结论

第二章 ICOS封闭性抗体联合疫苗治疗小鼠前列腺癌

2．1．1 实验材料

2．1．2 主要实验试剂和仪器

2．1．3 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 C57BL／6小鼠皮下前列腺癌模型的建立

2．2．2 小鼠前列腺癌皮下模型各组小鼠的肿瘤大小

2．2．3 流式细胞术检测血液中DC细胞、CD4+T和CD8+T淋巴细胞

2．2．4 流式细胞术检测睥脏中ICOS+Treg细胞

2．2．5 免疫组化检测肿瘤组织中CD4+T和CD8+T淋巴细胞

2．2．6 免疫荧光检测肿瘤组织中ICOS+Treg细胞

2．2．7 ELISA检测血清中IFN-γ，IL-4和IL-10的含量

2．2．8 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．1 C57 BL／6小鼠前列腺癌皮下模型的建立

2．3．2 肿瘤体积大小

2．3．3 流式细胞术分析血液中DC细胞的比例

2．3．4 流式检测小鼠外周血中的T细胞亚群的变化

2．3．5 免疫组化检测肿瘤组织中浸润性CD4+T和CD8+T细胞的含量

2．3．6 流式分析小鼠脾脏中的ICOS+Tregs细胞的变化

2．3．7 免疫组化检测肿瘤组织中ICOS+Treg细胞的含量

2．3．8 ELISA检测血清中IFN-γ，IL-4和IL-10的含量

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 NCTD对Tregs的影响及其联合疫苗治疗小鼠前列腺癌的疗效

3．1 实验材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要实验试剂和仪器

3．1．3 主要试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 脾细胞悬液的制备

3．2．2 分选CD4+CD25+Treg细胞

3．2．3 细胞培养

3．2．4 NCTD作用Treg细胞

3．2．5 CCK8检测Treg细胞增殖

3．2．6 流式检测Treg细胞凋亡

3．2．7 NCTD处理后的Treg细胞总蛋白的提取

3．2．8 western bloting检测目的蛋白的表达

3．2．9 提取NCTD处理后的Treg细胞的总RNA

3．2．10 Real Time PCR

3．2．11 SA-mGM-CSF膜修饰的前列腺癌细胞疫苗的制备

3．2．14 流式检测血液中淋巴细胞的比例

3．2．15 免疫组化检测肿瘤组织中淋巴细胞的含量

3．2．16 免疫荧光检测肿瘤组织中Treg细胞的含量

3．2．17 统计学分析

3．3 实验结果

3．3．1 CCK8检测细胞增殖结果

3．3．2 流式检测Treg细胞凋亡结果

3．3．3 Western blotting结果

3．3．4 Real Time PCR结果

3．3．5 小鼠前列腺癌皮下模型的建立及肿瘤体积大小

3．3．6 流式检测血液中DC细胞的含量

3．3．7 NCTD联合疫苗治疗后小鼠血液和肿瘤组织中Treg细胞含量

3．3．8 NCTD联合疫苗治疗后小鼠血液和肿瘤CD4+T和CD8+T含量

3．4 讨论

3．5 结论

全文总结与展望

参考文献

中英文缩略词表

成果

致谢

声明