摘要
第一章前言
1．1．2 APOL1的抗感染作用：抑制病原体的繁殖和限制病原体扩散
1．1．3 APOL1过表达诱发其细胞毒性
1．2肠道病毒71型研究现状
1．2．1 EV-A71感染中枢神经系统的机制还不明确。
1．2．2宿主内环境对EV-A71感染神经系统的影响
1．2．3EV-A71的复制
1．3本研究背景和意义
第二章沉默APOL1基因表达后对EV-A71复制的影响
2．1材料
2．1．2主要试剂
2．2实验步骤
2．2．1 RD细胞培养及EV-A71病毒扩增、滴度测定
2．2．2 HBMEC细胞培养以及EV-A71感染
2．2．3 siRNA转染HBMEC细胞及Real-time PCR检测细胞内Apol1的mRNA表达量
2．2．4EV-A71感染APOL1 siRNA转染后的HBMEC
2．3结果
2．3．1病毒扩增以及病毒滴度滴定
2．3．2 EV-A71感染HBMEc细胞
2．3．3 siRNA筛选结果
2．3．4病毒感染结果
2．4讨论
第三章利用CRISPR／Cas9系统敲除人脑微血管内皮细胞的载脂蛋白L1基因
3．1材料
3．1．1细胞株和质粒
3．1．2主要试剂
3．1．3常用试剂配方
3．2实验步骤
3．2．1慢病毒载体构建
3．2．2慢病毒质粒大量提取及慢病毒包装
3．2．3 Apol1基因的敲除
3．2．4 Apol1基因敲除株测序鉴定
3．2．5蛋白免疫印迹实验验证蛋白敲除
3．3结果
3．3．1 lenticrisprV2质粒构建
3．3．2慢病毒包装
3．3．3嘌呤霉素杀灭曲线建立
3．3．4阳性细胞筛选
3．3．5基因组测序鉴定HBMEC细胞内Apol1基因
3．3．6Western blot鉴定APOL1蛋白表达
3．4讨论
第四章可诱导表达载脂蛋白L1的293T稳定细胞株构建
4．1材料
4．1．1细胞株和质粒
4．1．2主要试剂
4．2实验步骤
4．2．1 Apol1基因获取与纯化
4．2．2重组质粒构建
4．2．3慢病毒包装以及嘌呤霉素杀灭曲线建立
4．2．4慢病毒感染以及嗓呤零素筛选
4．2．5细胞系鉴定
4．2．6CCK-8细胞增殖-毒性试验
4．2．7诱导后real-time RCR和western blot鉴定重组蛋白表达量
4．3结果
4．3．1重组质粒构建
4．3．2阳性细胞筛选及诱导鉴定
4．3．3CCK-8细胞增殖-毒性实验
4．3．4Real-time PCR以及Western Blot鉴定表达量
4．3讨论
第五章细胞内APOL1蛋白在EV-A71感染细胞中的作用的初步研究
5．1材料
5．1．1细胞株
5．1．2主要试剂
5．2实验步骤
5．2．2 EV-A71感染APOL1基因可诱导表达细胞
5．2．3 Real-time PCR检测细胞内病毒VP1基因相对含量
5．3结果
5．3．2 EV-A71感染APOL1基因可诱导表达细胞株
5．4讨论
全文总结
参考文献
附录
研究生期间获得的成果
致谢
声明
