HCMV UL144和UL145基因在低传代临床分离株中结构和表达的初步研究

摘要

目的：本文主要研究HCMV UL144和UL145基因在低传代临床分离株中的多态性并检测它们mRNA的表达情况,为研究它们的多态性与先天性HCMV感染不同致病性之间的关系奠定基础,为揭示这两个基因编码产物的功能和先天性HCMV感染的致病机理提供更丰富的资料。
　　方法：从先天性感染HCMV的新生儿尿液中分离出HCMV病毒,接种至生长良好的人胚肺成纤维细胞中；收集感染病毒后出现病变的细胞；抽提病毒DNA,根据GeneBank公布的HCMV Toledo株UL144和UL145基因全序列及有关文献,从临床毒株DNA中扩增分离出UL144和UL145基因片段,并克隆入pMD18-T载体；对重组体进行测序鉴定；应用生物信息学方法分析它们的多态性；抽提病毒RNA,通过RT-PCR技术检测UL144和UL145基因mRNA的表达情况。
　　结果：从HCMV的低传代临床分离株PCR扩增出UL144和UL145基因全序列,克隆到pMD18-T载体并测序。不同临床分离株UL144基因与Toledo株进行同源性比较,结果核苷酸水平为98.5~99.2%,氨基酸水平为98.6~99.4%；UL145基因与Toledo株的核苷酸同源性为97.2~97.8%,氨基酸水平为97.8~98.5%。从HCMV临床分离株的细胞培养物中均能检测到UL144和UL145基因mRNA的表达。
　　结论：成功分离了4株HCMV临床分离株,并从中扩增了HCMV UL144和UL145基因并克隆,验证了UL144和UL145基因的多态性；并首次在体外培养人胚肺成纤维细胞中检测到UL145 mRNA的表达。

目录

摘要

ABSTRACT

一． 前言

1． HCMV背景简介

1．1 HCMV的病毒学特征

1．2 病毒感染的致病机理

1．3 病毒的复制

1．4 HCMV感染临床症状

1．5 HCMV的诊断及治疗

2． UL144、UL145基因简介

3． 课题意义

二． 技术路线

三． 实验仪器与材料

1． 主要仪器

2． 实验材料

2．1 细胞和菌种

2．2 主要试剂

2．3 其它主要试剂的配方

四． 实验方法

1． HCMV的分离和培养

1．1 病毒的收集

1．2 病毒的分离

1．3 病毒的培养

2． 病毒DNA的提取

3． HCMV低传代临床分离株鉴定

3．1 引物的设计

3．2 PCR扩增

4． UL144基因的扩增、克隆

4．1 UL144基因的扩增

4．2 UL144基因的克隆

4．3 UL144克隆质粒测序

5． UL145基因的扩增、克隆

5．1 UL145基因的扩增

5．2 UL145基因的克隆及测序

6． HCMV总RNA的提取

7． HCMV RNA的纯化

8． HCMV RNA的鉴定

8．1 鉴定RT-PCR引物设计

8．2 HCMV mRNA逆转录成cDNA

8．3 PCR鉴定HCMV IE基因mRNA

9． UL144基因的RT-PCR扩增

10． UL145基因的RT-PCR扩增

五． 结果与分析

1． 病毒的分离与培养

1．1 人胚肺成纤维细胞培养结果

1．2 感染病毒后人胚肺细胞出现病变效应

2． HCMV的鉴定

3． PCR扩增UL144、UL145基因

3．1 PCR扩增UL144基因

3．2 PCR扩增UL145基因

4． UL144、UL145基因的克隆

4．1 UL144基因的克隆

4．2 UL145基因的克隆

4．3 UL144、UL145基因克隆结果鉴定

5． 克隆质粒pMD18-UL144、pMD18-UL145的鉴定

5．1 克隆质粒pMD18-UL144的鉴定

5．2 克隆质粒pMD18-UL145的鉴定

6． HCMV RNA的提取

7． 通过RT-PCR技术鉴定HCMV mRNA的表达

8． UL144、UL145基因表达的鉴定

8．1 UL144基因表达的鉴定

8．2 UL144基因RT-PCR产物的克隆鉴定

8．3 UL145基因的表达鉴定

8．4 UL145基因RT-PCR产物的克隆及鉴定

9． HCMV UL144、UL145基因核苷酸和氨基酸序列分析结果

9．1 核苷酸序列及其编码蛋白氨基酸序列的多态性

9．2 编码蛋白翻译后修饰位点分析结果

9．3 HCMV UL144、UL145编码蛋白质性质预测

9．4 UL144和UL145基因编码蛋白质二级结构和功能预测

六． 讨论

1． 病毒的分离和培养

2． 病毒的鉴定

3． UL144和UL145基因的PCR扩增

4． 病毒mRNA的检测

5． UL144和UL145基因核苷酸和氨基酸序列分析

6． UL145开放阅读框编码产物分析

七． 小结

八． 附录

附录1 GeneBank公布的UL144基因全序列

附录2 GeneBank公布的UL145基因全序列

附录3 UL144基因全长测序结果(一)

附录4 UL144基因全长测序结果(二)

附录5 UL145基因全长测序结果(一)

附录6 UL145基因全长测序结果(二)

九．参考文献

致谢