人MSC灌注生物反应器培养及其与生物材料生物相容性研究

摘要

目的：本研究拟建立组织工程种子细胞人骨髓间充质干细胞(MSC)灌注生物反应器体外培养(扩增)方法；并通过MSC与新型可降解材料生物相容性的体外研究,建立一种基于MSC的生物相容性体外评价方法。
　　方法：研制一套灌注生物反应器系统,在完成性能、功能测试(C2C12灌注培养)后进行MSC灌注培养研究；建立离/在线监测体系,检测MSC形态、生长代谢、增殖和成骨分化能力的变化。在生物相容性研究中,利用MSC的增殖与分化能力作为指标,通过扫描电镜观察MSC在可降解偏磷酸钙(dCMP)表面粘附的情况,并利用ICP和IC分析dCMP和羟基磷灰石(HA)的降解产物元素含量,同时采用FACS检测细胞周期变化、ALP活性分析及ARS染色两种方法检测MSC成骨分化能力,从而实现对降解产物毒性效应的检测。
　　结果：灌注生物反应器系统在结构上具有合理性和可靠性。通过离/在线监测体系,发现对C2C12细胞形态无显著不良影响情况下,可显著性缩短细胞群体倍增时间：对MSC的细胞形态、代谢、增殖和分化能力无显著不良影响；提高培养基的使用效率,具有安全性、可行性和一定的高效性。在生物相容性研究中,dCMP对MSC的增殖有促进作用,且不影响MSC的成骨分化进程及分化后的矿化功能；而HA对MSC的成骨分化进程无影响,但对MSC的增殖和成骨分化后的矿化功能均有抑制作用。
　　结论：MSC可在灌注生物反应器中实现体外培养(扩增)；灌注生物反应器基本构建完成。同时,基本建立基于MSC的生物相容性体外评价方法；dCMP的生物相容性较HA为佳,更适合作为骨替代材料。

目录

缩略词表

摘要

ABSTRACT

第一章 前言

1.1 MSC的基础研究

1.1.1 MSC的发现及其特征

1.1.2 MSC的成骨分化

1.2 MSC的应用研究

1.2.1 MSC的应用领域

1.2.2 骨组织工程的研究进展

1.2.3 组织工程中的生物相容性研究

1.3 干细胞生物反应器体外培养的研究进展

1.3.1 动物细胞培养生物反应器

1.3.2 干细胞的生物反应器培养

1.4 本研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 主要实验材料

2.2 主要实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 细胞培养

2.3.2 MSC成骨诱导

2.3.3 生物材料接种细胞的方法

2.3.4 相差显微镜观察

2.3.5 扫描电镜观察

2.3.6 生长曲线

2.3.7 细胞群体倍增时间

2.3.8 MTT法分析增殖能力

2.3.9 流式细胞术检测

2.3.10 细胞生长代谢情况的离线检测方法

2.3.11 胞内碱性磷酸酶定量分析

2.3.12 矿化结节茜素红染色

2.3.13 材料及浸提液的制备和元素分析

2.3.14 统计方法

第三章 MSC灌注生物反应器培养的初步研究

3.1 灌注生物反应器的设计、构建与测试

3.1.1 灌注生物反应器的设计与构建

3.1.2 灌注生物反应器性能测试实验

3.1.3 灌注生物反应器功能评价实验

3.2 MSC灌注生物反应器培养

3.2.1 实验目的

3.2.2 策略与路线

3.2.3 结果

3.3 讨论

3.3.1 关于C2C12细胞群体倍增时间与细胞密度峰值

3.3.2 关于MSC细胞群体倍增时间与细胞密度峰值

3.3.3 流速控制

3.3.4 在线监测细胞代谢的问题

3.3.5 关于取样方式

3.3.6 关于灌注生物反应器的安全性与高效性

3.4 本章小结

3.5 附图

第四章 MSC与新型可降解材料生物相容性的体外实验研究

4.1 实验目的

4.2 实验策略与路线

4.3 结果

4.3.1 浸提液元素分析

4.3.2 直接接触法的相差显微镜观察

4.3.3 直接接触法的扫描电镜观察

4.3.4 浸提液法细胞增殖的流式细胞术检测

4.3.5 浸提液法细胞分化检测Ⅰ(碱性磷酸酶定量分析)

4.3.6 浸提液法细胞分化检测Ⅱ(矿化结节茜素红染色)

4.4 讨论

4.4.1 生物材料对MSC形态学、增殖与分化的影响

4.4.2 浸提液元素含量与实验结果的关系

4.4.3 全量换液与半量换液两种培养方式的比较

4.5 本章小结

4.6 附图

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

在学期间发表的论文及科研成果清单

致谢