蜡状芽胞杆菌对芘的生物降解及其降解基因的克隆与表达

摘要

本论文以蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）为实验菌株，对水体中芘的微生物修复进行了研究，考察其对芘的降解性能，分析其代谢产物和相关功能基因及功能酶，以期从分子生物学角度阐明芘在菌体内的降解机理。
　　B. cereus降解芘的最优无机盐培养基浓度为：K2HPO4100 mg·L-1，KH2PO4100 mg·L-1，MgSO4·7H2O20 mg·L-1和柠檬酸钠100 mg·L-1。在降解体系中加入1 mg·L-1 Mn2+、0.1 mg·L-1 Fe3+和10 mg·L-1葡萄糖混合物对芘的降解有明显促进作用；1 g·L-1菌体在120 h内对2.5μmol·L-1芘的降解率达到61.4％。
　　利用LC-MS/MS分析芘代谢产物，检测到1-萘酚、2-萘酚、9-羟基菲和1-羟基芘4种单羟基多环芳烃，表明芘在单加氧酶作用下开环降解，且B. cereus能有效分解利用4种代谢产物，其最高利用率分别为100%，90.3%，98.3%和52.7%。酶活力分析实验结果表明，B. cereus具有的水杨酸羟化酶，邻苯二酚1,2-双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶在芘的降解中起关键作用，其酶活力经芘诱导后均有明显提高。结合产物分析及酶活测定推断B. cereus对芘的降解途径以及降解过程是由单加氧酶和双加氧酶联合起作用。
　　通过设计引物，利用PCR扩增技术，从B. cereus的质粒中克隆出邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23O）基因，对其进行序列测定和分析。该基因全长924 bp，具有一个完整开放阅读框的序列，编码307个氨基酸氨基酸组成的C23O。理论蛋白分子量为35.16 kDa，等电点为5.46。编码区G+C含量为61.8%，A+T含量为38.2%。将该C23O基因序列与NCBI数据库中已收录的其它菌株的C23O基因序列进行比对，分析相关菌属亲缘进化关系，结果显示B. cereus的C23O基因与假单胞菌属（Pseudomonas）菌株C23O基因的相似性最高。
　　利用pET32a(+)质粒对C23O基因构建了重组表达载体，成功在表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组菌株酶活检测表明，重组蛋白在表达宿主菌中主要以胞内酶的形式存在。

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第1章 绪论

1.1 环境中PAHs污染

1.2 PAHs污染的微生物修复

1.3 PAHs降解过程中的关键酶及其基因

1.4 本论文研究工作

1.5 技术路线

1.6 创新点

第2章 B. cereus对芘的降解特性

2.1 材料与设备

2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第3章 邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的克隆及序列分析

3.1 材料与设备

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第4章 邻苯二酚2,3-双加氧酶基因在大肠杆菌中的表达

4.1 材料与设备

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第5章 结论

参考文献

致谢