二氢杨梅素对UVA诱导的HaCaT细胞光损伤保护作用及机制研究

摘要

皮肤作为人体与外界直接接触的器官不仅会随着年龄的增加发生自然老化，而且随着全球环境问题的日益严峻，日光中紫外线对皮肤的损伤作用越来越显著，光老化的进程加快。因此对有效的光损伤保护剂的开发与利用将有助于人们的健康生活。藤茶中的二氢杨梅素（Dihydromyricetin,DHM)是有效的抗氧化剂，目前已见于众多的保健品中。
　　目的：以长波紫外线(UVA)辐射永生化人角质形成细胞(HaCaT)建立光损伤模型，在此基础上给予DHM处理，探讨DHM对UVA辐射下的永生化人角质形成细胞(HaCaT)的保护作用及可能的作用机制。
　　方法：为了构建UVA辐射诱导的HaCaT细胞凋亡模型，以MTT法和流式细胞Annexin V-PI染色法检测细胞增殖活性和凋亡率，并通过Q-PCR检测凋亡和炎性基因的表达水平。酶化学方法检测谷光甘肽过氧化物酶（GSH-Px)的活性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平，以二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA)为荧光探针，激光共聚焦检测DHM对UVA辐射后HaCaT细胞内ROS生成的影响；JC-1染料检测线粒体膜电位；激光共聚焦检测p65的核定位；蛋白印迹法检测(p)-JNK,（p)-p38，促凋亡蛋白Bax，Bid，抑凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl和活化的caspase-3，caspase-9和PARP的表达。
　　结果：10J/cm2UVA照射HaCaT细胞后24h能够引起50％细胞的凋亡，在照射后的8h促凋亡基因Bax表达显著增加，炎性相关基因Cox-2，IL-1β，IL-6在照射后的1h表达增加；1.25?10^M剂量范围内的DHM能抑制UVA诱导的HaCaT细胞的凋亡，促凋亡基因Bax的表达以及炎性相关基因Cox-2，IL-1P，IL-6的表达以及ROS的生成，并能够提高细胞内抗氧化酶GSH-Px的活性，减少MDA的产生，抑制UVA辐射所引起的HaCaT细胞线粒体膜电位的下降；同时1.25?10μM剂量范围内的DHM还能抑制HaCaT细胞内p65的核转运，JNK的磷酸化以及促凋亡蛋白Bax的表达，caspase-3，caspase-9和PARP的活化并促进抑凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl的表达。
　　结论：DHM能作为抗氧化剂提高HaCaT细胞的抗氧化能力，减少ROS的生成，进而阻断了线粒体途径的凋亡，抑制了下游caspase通路的活化，从而抑制了UVA辐射诱导的HaCaT细胞的凋亡。同时DHM还能抑制HaCaT细胞内炎性相关基因的表达。

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第一部分前言

1 .1紫外线与皮肤衰老

1 .2细胞凋亡的线粒体通路的激活

1.3皮肤抗氧化剂的研究

1.4 DHM的生理功能研宄

第二部分实验材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

第三部分实验结果

1.DHM对HaCaT细胞的毒性测定

2.构建UVA辐射损伤的细胞模型

3.DHM对UVA辐射的HaCaT细胞活性的影响

4.DHM影响UVA辐射的角质形成细胞内ROS的生成

5.DHM影响UVA辐射的角质形成细胞线粒体膜电位

6.DHM对UVA辐射角质形成细胞凋亡相关基因mRNA及蛋白表达量的影响

7.DHM对UVA辐射角质形成细胞DNA损伤的影响

8.DHM对UVA辐射角质形成细胞炎性因子mRNA表达量的影响

9.DHM对UVA辐射角质形成细胞p65核定位的影响

10.DHM对UVA辐射角质形成细胞MAPKs通路的影响

11.DHM对UVA辐射角质形成细胞GSH-Px和M D A的影响

12.结论

第四部分讨论与展望

1.讨论

2.总结与展望

参考文献

在校期间发表论文

致谢