枸杞子抗阿尔茨海默病活性成分研究

摘要

宁夏枸杞是茄科枸杞属灌木，自然生长于亚洲地区，主要分布在中国西北部。枸杞子是我国传统名贵中药材，始载于神农本草经，被列为上品。《中华人民共和国药典》2015版规定，枸杞子（wolfberry。goji berry）为茄科植物宁夏枸杞（Lycium barbarum）的干燥成熟果实，具有滋肝补肾、益精明目的功效。目前，枸杞子作为中药及功能食品在全世界范围广泛使用。现代药理学研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、神经保护、抗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease。AD）和保肝等药理活性。大量文献研究表明了枸杞多糖、多酚及类胡萝卜素类是枸杞子中的主含活性成分。
　　本论文运用大孔树脂柱色谱、硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及反相高效液相色谱法等现代色谱学分离手段，对枸杞子60％乙醇提取物进行了系统的化学成分分离，从中共分离得到了83个化合物。通过理化性质、现代波谱学手段（UV、IR、MS、NMR）和化学方法，鉴定了这些化合物的结构，包括15个二咖啡酰亚精胺类衍生物（1?15），15个苯丙酰苯乙胺衍生物（16?30），28个苯丙素类化合物（31?58），4个香豆素类化合物（59?62），8个木脂素类化合物（63?70），5个黄酮类化合物（71?75），3个异黄酮类化合物（76?78），2个绿原酸类衍生物（79和80）和3个苯甲酸类衍生物（81?83）。其中，27个为新化合物，即 lycibarbarspermidines A?O（1?15）、N-(4-O-β-D-glucopyranosyl-cis-feruloyl)-tyramine（16）、(7''S*,8''R*)-canabisine H（25）、lycibarbarphenylpropanoids A?I（31?39）和lycibarbarcoumarin A（59）。29个已知化合物（17?19、24、27、29、30、40?49、54、56?58、64?66、69、70和76?78）首次从枸杞属植物中分离获到。本研究首次从枸杞子中分离得到了二咖啡酰亚精胺类衍生物、木脂素和异黄酮类成分。二咖啡酰亚精胺类衍生物是一类稀有的植物次级代谢产物，主要分布在茄科植物中。目前，这类化合物仅鉴定了6个，均为直链的非糖苷化产物。本研究所报道的化合物1?15是首例二咖啡酰亚精胺类衍生物糖苷化产物，其中化合物14?15是首次报道的二咖啡酰亚精胺类衍生物环化产物。通过分析化合物分离纯化流程可知，二咖啡酰亚精胺类衍生物是枸杞子中一类主含特征性成分。
　　本课题组前期采用转基因AD果蝇模型，筛选出枸杞子提取物能显著性改善果蝇短时学习记忆能力。本研究也采用该模型，对枸杞子提取物大孔树脂各洗脱馏分进行抗AD活性评价，发现主要馏分 LBB（大孔树脂30%乙醇-水洗脱馏分）能显著性改善果蝇短时学习记忆能力。我们对馏分 LBB进行分离，首次发现了枸杞子中一类主含特征性成分，二咖啡酰亚精胺类衍生物。同时，我们借助转基因AD果蝇模型，对主含特征性成分二咖啡酰亚精胺类衍生物进行抗AD活性评价。实验结果表明，所有二咖啡酰亚精胺类衍生物均不同程度地改善果蝇短时学习记忆能力。因此，二咖啡酰亚精胺类衍生物是枸杞子中一类主含特征性的抗AD活性成分。
　　本研究也采用分子水平筛选模型，如ThT模型、Ellman模型、DPPH自由基清除实验和oxygen radical absorbance capacity(ORAC)实验，对枸杞子中所有单体化合物进行体外抗 AD及抗氧化活性评价。实验结果表明，所有化合物均显示了不同程度的oxygen radical absorbance capacity(ORAC)，部分化合物显示了DPPH自由基清除活性。化合物58显示出乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制作用，没有化合物显示Aβ42蛋白聚集抑制作用。我们初步对苯丙素类化合物?ORAC能力及苯丙素类化合物?DPPH自由基清除能力构效关系进行了讨论。以上实验结果有助于从分子水平理解枸杞子抗AD和抗氧化功能的科学内涵。

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第一章 前言

1.1 阿尔茨海默病研究概述

1.2 枸杞子研究概述

1.2.1 枸杞子药材基源及应用历史

1.2.2 枸杞属植物化学成分研究进展

1.2.3 枸杞子生物活性研究进展

1.3 小结与展望

第二章 枸杞子化学成分研究

2.1 枸杞子化学成分分离

2.2 分离得到的化合物编号、名称和结构

2.3 化合物的结构鉴定

第三章 枸杞子抗阿尔茨海默病活性评价

3.1 实验方法

3.1.1 转基因AD果蝇模型[12,13,117-120]

3.1.2 硫磺素T（ThT）结合试验[13,121]

3.1.3 AChE酶抑制实验（Ellman assay）[122]

3.1.4 DPPH自由基清除实验[123]

3.1.5 ORAC实验[124]

3.2 活性测试结果

3.2.1 转基因AD果蝇模型活性测试结果

3.2.2 ThT结合实验活性测试结果

3.2.3 AChE酶抑制实验活性测试结果

3.2.4 DPPH自由基清除实验活性测试结果

3.2.5 ORAC实验活性测试结果

3.2.6 苯丙素类成分抗氧化构效关系

3.3 活性评价小结

第四章 实验部分

4.1 实验仪器及材料

4.1.1 化学实验仪器

4.1.2 药理实验仪器

4.1.3 常用化学实验试剂

4.1.4 药理实验用试剂

4.1.5 植物药材

4.2 新化合物结构鉴定数据

第五章 小结与讨论

参考文献

论文发表和专利申请情况

致谢

新化合物附图