邻苯二甲酸酯降解菌的筛选、降解特性及其在土壤修复中的应用研究

摘要

农业生产中塑料薄膜、农药和化肥大规模地使用，以及污水灌溉和污泥的施用，使得农田土壤中邻苯二甲酸酯（PAEs）的污染严重。PAEs对农田土壤的污染不仅会破坏土壤的质量和生产功能，还能够进入食物链进行富集，威胁人体健康。因此，如何消除农田PAEs污染已经成为亟待解决的问题。微生物降解被认为是自然环境中PAEs降解的主要途径。大量的PAEs降解菌已从不同环境中被分离出来，但从粪肥中分离尚鲜见报道。有研究表明向土壤中施加粪肥有利于土壤中PAEs的降解，但粪肥降解PAEs的作用机制并不明确。本研究以粪肥为起始接种物，分离获得PAEs高效降解菌，并进行菌种鉴定；测定其降解特性，优化降解条件；鉴定其降解产物，克隆获得PAEs关键降解酶基因，综合分析其降解途径；利用降解菌对PAEs污染的土壤中进行修复实验，揭示粪肥与PAEs降解菌在修复过程中的互作机制，为PAEs污染土壤的生物修复提供理论依据。主要研究结果如下：
　　（1）降解菌株的筛选与鉴定。以4种PAEs为受试污染物，使用浓度梯度驯化的方法，从粪肥中分离筛选获得一株邻苯二甲酸二丁酯（DBP）降解菌。根据菌株的形态学特征、生理生化特性以及16S rDNA序列同源性鉴定，确定该菌株为普罗维登氏菌（Providencia sp.2D）。
　　（2）菌株降解特性研究及降解条件优化。通过单因素试验，研究温度、pH和接菌量对Providencia sp.2D降解性能的影响；再通过Central Composite Rotatable Design响应曲面优化设计，最终确定Providencia sp.2D最佳的降解条件为：温度32.4℃，pH8.3，接菌量0.6（OD600）。在最佳降解条件下，Providencia sp.2D的降解动力学实验结果表明：培养72h后，菌株2D对不同初始浓度DBP（50～1000mg/L）的降解率均达到80％以上，且降解过程符合一级动力学模型，降解半衰期处于8～27h之间。
　　（3）降解产物的鉴定、降解酶的克隆及降解途径分析。通过GC-MS技术对DBP及降解中间产物分析，克隆与验证了Providencia sp.2D其降解关键酶基因，并进行了相关厌氧条件下的降解试验，最终推测其降解途径。
　　第一步：在Providencia sp.2D的作用下，DBP通过一次或二次酯键断裂直接或间接生成邻苯二甲酸（PA）；
　　第二步：Providencia sp.2D对PA的降解。好氧或厌氧条件下，Providencia sp.2D对PA可能表现出不同的降解途径：好氧条件下，Providencia sp.2D可编码生成邻苯二甲酸4，5-双加氧酶，PA在其催化作用下被转化为4，5-二羟基邻苯二甲酸，4，5-二羟基邻苯二甲酸再经过脱羧反应，转化为 PCA，之后在Providencia sp.2D编码生成的原儿茶酸4，5-双加氧酶的催化作用下，PCA被转化为小分子有机酸，最终被矿化为CO2和H2O；在氧气浓度较低的情况下，兼性厌氧性的Providencia sp.2D更倾向于通过脱羧反应将PA转化为苯甲酸（BA）；
　　第三步：Providencia sp.2D对BA的降解。BA可在无氧条件下被Providencia sp.2D彻底矿化为CO2和H2O；好氧条件下BA可被转化为原二茶酸（PCA）或邻苯二酚，之后被进一步矿化为CO2和H2O。
　　（4）Providencia sp.2D对DBP污染土壤和施加粪肥的DBP污染土壤的降解动力学研究。结果表明，Providencia sp.2D可高效降解土壤中DBP，且降解过程中可与土壤中的土著微生物发生协同作用共同促进土壤中DBP的降解；粪肥的施加能够大幅度提高微生物对DBP的降解率。因此Providencia sp.2D对DBP污染土壤环境具有巨大的修复潜能。

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1. 前言

1.1 邻苯二甲酸酯类有机污染物的环境污染

1.2 邻苯二甲酸酯的降解技术

1.3立题意义和研究思路

2. DBP降解菌的筛选、分离和鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 本章小结

3. 菌株2D降解DBP的降解条件优化及降解特性研究

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 本章小结

4. DBP降解产物的鉴定及降解途径分析

4.1 材料与方法

4.2 结果分析与讨论

4.3 本章小结

5. Providencia sp. 2D对DBP污染土壤的修复效果研究

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 本章小结

6. 总结与展望

6.1 主要结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

在校期间发表的论文与获得的荣誉

致谢