氯通道在冰片促进阿霉素及罗丹明跨血脑屏障中的作用

摘要

目的：冰片可以促进药物通过血脑屏障，但机制尚不清楚。我们前期研究结果表明，ClC-3氯通道与物质跨细胞膜转运有关。氯通道在药物通过血脑屏障中是否起作用，目前未见文献报道。本文探讨ClC-3氯通道在冰片促进阿霉素及罗丹明跨血脑屏障转运中的作用。
　　方法：实验选用野生型FVB小鼠和ClC-3过表达转基因FVB小鼠，雌雄各半，体重为20-30 g。首先建立阿霉素、罗丹明浓度标准曲线，通过标准曲线得到相应的浓度。用全自动酶标仪测定小鼠脑脊液及血清中阿霉素、罗丹明的荧光值。免疫组织化学法检测分析野生型及ClC-3过表达转基因小鼠脑切片ClC-3表达及分布。透射电镜观测小鼠脑微小血管图像的变化。膜片钳记录冰片激活的人脐静脉血管内皮细胞氯电流。活细胞实时动态监测及拍摄细胞图像，分析冰片和氯通道阻断剂tamoxifen、DIDS对血管内皮细胞容积的影响。
　　结果：小鼠腹腔注射阿霉素后，血清中阿霉素显著高于脑脊液中阿霉素(P<0.01)，表明阿霉素不容易通过血脑屏障。在冰片灌胃后给予阿霉素，脑脊液中的阿霉素比单纯注射阿霉素组显著增高2.48倍（P<0.01），达到血清阿霉素组浓度的37.2％，而冰片作用前后，血清中的阿霉素浓度没有明显变化（P>0.05）。表明冰片有促进阿霉素通过血脑屏障的作用。氯通道阻断剂tamoxifen及 DIDS作用后，逆转冰片开放血脑屏障的作用，脑脊液中的阿霉素浓度明显降低（P<0.01）。
　　在冰片灌胃后给予罗丹明，脑脊液中的罗丹明浓度明显增高（P<0.01），比单纯注射罗丹明组提高了1.90倍，Tamoxifen及DIDS抑制冰片的作用，脑脊液中的罗丹明浓度明显降低（P<0.01）。而冰片作用前后，血清中的罗丹明浓度没有明显变化（P>0.05）。
　　根据鼠尾基因检测结果，在长波紫外光下观察琼脂糖凝胶上的PCR条带，在440bp处出现条带者为阳性小鼠即ClC-3过表达小鼠。与野生型小鼠组相比，ClC-3过表达小鼠脑脊液阿霉素、罗丹明显著升高（P<0.01），提示高表达ClC-3氯通道可提高血脑屏障通透性，氯通道阻断剂tamoxifen及DIDS可抑这一作用（P<0.01）。给予ClC-3过表达组冰片24h口服比起单纯ClC-3组及冰片组显著提高阿霉素及罗丹明123进入脑脊液（P<0.05）。与野生型小组比较，ClC-3过表达小鼠脑脊液阿霉素、罗丹明增加（P<0.05），提示冰片对ClC-3过表达鼠开放血脑屏障作用更显著。
　　免疫组化结果显示，ClC-3过表达小鼠的脑膜血管大量表达ClC-3，比野生型组高29%（P<0.01）。透射电镜观察到冰片组及ClC-3过表达组脑膜血管内皮细胞吞饮小泡增多，紧密连接松解。
　　膜片钳结果显示，冰片可以激活人脐静脉内皮细胞细胞氯电流。在细胞外灌流等渗溶液时，细胞的基础电流很小。20μmol/L冰片溶液灌流细胞后，明显激活一个氯电流（P<0.01）。外向电流较大（32.65±4.97） pA·pF－1（+80 mV），内向电流较小（－23.90±3.21） pA·pF－1（－80 mV），呈现较明显的外向优势，无时间及电压依赖性的失活。该电流具有容积敏感性，被细胞外高渗液完全抑制。DIDS使冰片激活的外向电流从（28.93±6.32） pA·pF－1下降到（6.63±1.50） pA·pF－1（P<0.01），抑制率为（95.4±3.9）%，DIDS对内、外向电流的抑制率差异无显著性。在+80 mV电压钳制时，Tamoxifen使冰片激活的外向电流从（32.10±5.67）pA·pF－1下降到（6.49±1.38）pA·pF－1（P<0.01），抑制率为（94.2±3.8）%，对内、外向电流的抑制率差异无显著性。本结果进一步证实冰片激活的电流是氯通道介导的氯电流。
　　活细胞图像分析显示，人脐静脉内皮细胞外灌流20μmol/L冰片溶液60 min，细胞容积缩小（12.6±2.1）%（P<0.01），该作用可被氯通道阻断剂tamoxifen和DIDS明显抑制（P<0.01），tamoxifen与DIDS的抑制效果间无显著性差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1、冰片可提高小鼠血脑屏障通透性，有助于阿霉素、罗丹明进入脑组织；
　　2、ClC-3过表达可促进阿霉素、罗丹明通过血脑屏障；
　　3、冰片可能激活血管内皮细胞ClC-3氯通道，引起细胞内Cl-和水外流，细胞体积缩小，细胞间隙增大，紧密连接松解，开放血脑屏障。氯通道在冰片开放血脑屏障中起重要作用。

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1 前言

1.1血脑屏障

1.2氯通道

1.3 ClC家族

1.4 ClC-3通道

1.5冰片

1.6罗丹明123

1.7阿霉素

1.8 本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

2.3统计分析统计学结果分析

3结果

3.1 鼠尾基因检测

3.2 氯通道在阿霉素跨血脑屏障中的作用

3.3 氯通道在罗丹明跨血脑屏障中的作用

3.4小鼠脑膜ClC-3的表达

3.5 透射电镜结果

3.6全细胞膜片钳技术记录氯电流

3.7 冰片引起的细胞容积缩小可被氯通道阻断剂 tamoxifen 和 DIDS明显抑制

4 讨论

5结论

参考文献

在校期间发表的论文

致谢