ACK1基因扩增调控胃癌发生和转移的机制及其与临床预后关系的研究

摘要

研究背景和意义：
　　胃癌是目前全球高发的恶性肿瘤之一。手术切除以及放化疗是治疗胃癌患者的主要手段。胃癌早期发病症状隐匿，临床上一经确诊时，往往已经是晚期和发生了转移，从而导致胃癌患者的预后较差。靶向小分子/抗体特异抑制癌基因作为一种治疗策略受到广泛关注，此策略的关键在于找到胃癌发生和转移的靶点，以作为新的药物治疗靶标。前期研究发现ACK1基因在胃癌中可能存在扩增，提示ACK1与胃癌的发生发展相关。因此，本论文着重研究ACK1在胃癌中的临床意义以及分子机制。
　　方法与结果：
　　1.通过分析Oncomine数据库，发现ACK1基因的DNA拷贝数和mRNA水平在胃癌组织中显著上调。
　　2.通过分析胃癌临床样品中ACK1蛋白的表达与预后的关系，发现ACK1蛋白在胃癌组织中上调且与胃癌患者预后差密切相关。
　　3.通过使用 Transwell小室、流式细胞仪等其它方法，我们检测了沉默 ACK1和过表达ACK1后对胃癌细胞增殖、克隆形成、细胞周期、细胞凋亡、EMT以及细胞迁移侵袭能力的影响。过表达ACK1促进了胃癌细胞EMT和迁移侵袭。沉默ACK1抑制了胃癌细胞增殖、克隆形成、EMT和迁移侵袭。沉默ACK1诱导胃癌细胞发生G2/M阻滞和细胞凋亡。
　　4.采用小鼠肿瘤异种移植裸鼠模型以及体内肺转移模型，证实稳定沉默 ACK1抑制胃癌细胞的裸鼠成瘤能力和肺转移能力。
　　5.通过采用Transwell、流式细胞仪、基因干扰等其它实验方法，证实ECD在ACK1促进胃癌细胞增殖、克隆形成、迁移侵袭以及EMT中发挥重要作用。
　　6.采用双荧光报告基因分析、染色质免疫共沉淀技术、基因干扰技术以及其它方法，阐明了ACK1通过激活AKT-POU2F1-ECD通路促进胃癌发生和转移的分子机制。
　　7.阐明了ACK1通过ECD依赖的方式促进p53蛋白泛素化降解。
　　结论：
　　1．ACK1基因扩增导致其蛋白在胃癌组织中上调，这一上调与胃癌临床预后差密切相关。
　　2．证实了ACK1促进胃癌细胞增殖、克隆形成、EMT和侵袭转移的生物学功能。
　　3．阐明了ACK1通过激活AKT-POU2F1-ECD通路，从而促进胃癌发生和转移。
　　4．阐明了ACK1通过ECD依赖的方式促进p53蛋白的泛素化降解。

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第一章 前 言

1.1 肿瘤转移的主要步骤

1.2 上皮间质转化（EMT）在胃癌转移中的作用

1.3 PI3K/AKT通路在肿瘤中的作用

1.4 ACK1研究进展

1.5 ECD和肿瘤

1.6 POU2F1与肿瘤

第二章 主要技术路线

第三章 材料与试剂

3.1 主要材料

3.2 主要试剂

3.3 主要实验仪器

3.4 主要溶液配制

第四章 实验方法

4.1 siRNA转染（基因干扰）

4.2 表达质粒瞬时转染

4.3 Trizol法提取RNA

4.4 质粒抽提

4.5 普通PCR和Real-time qPCR

4.6 构建表达质粒

4.7 定点突变载体构建

4.8 Transwell检测细胞迁移和细胞侵袭实验

4.9 细胞生长曲线实验

4.10 克隆形成实验

4.11 细胞凋亡实验

4.12 细胞周期实验

4.13 蛋白质印迹法（Western Blot）

4.14 蛋白质免疫共沉淀实验（CO-IP）

4.15 免疫组织化学实验（IHC）

4.16 染色质免疫共沉淀（ChIP）

4.17 双荧光报告实验( Dual-Luciferase Reporter Assay )

4.18 构建稳定敲低ACK1细胞株

4.19 NOD-SCID小鼠肺转移瘤实验

4.20 裸鼠成瘤实验

4.21 统计学分析

第五章 实验结果

第一部分ACK1与胃癌临床病理特征以及预后的关系

第二部分 ACK1在胃癌细胞中的生物学功能研究

第三部分ACK1通过激活AKT-POU2F1-ECD通路，促进胃癌发生和转移的分子机制

第六章 讨 论

6.1 ACK1蛋白在胃癌组织中上调与其病理特征和临床预后的关系

6.2 ACK1促进胃癌发生和转移

6.3 ACK1促进胃癌发生和转移的分子机制

第七章 全文总结

本论文创新点

展望

参考文献

附录

博士期间发表文章

致谢