棉酚通过非经典炎症小体通路诱导小鼠巨噬细胞发生焦亡

摘要

目的：棉酚(Gossypol,GOS)是从棉籽中分离提取的黄色多酚羟基双萘醛类化合物，具有抗真菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理学活性，但关于其对炎症小体活性影响方面的研究未见报道。本课题利用细菌脂多糖（Lipopolysaccharide。LPS）激活的小鼠腹腔巨噬细胞以及RAW264.7细胞系，检测GOS对巨噬细胞中炎症小体活化的影响，探讨GOS激活巨噬细胞炎症小体通路的作用机制，为深入研究GOS对固有免疫细胞的药理和毒理作用提供实验依据。
　　方法：
　　1.通过腹腔注射3％巯基乙酸盐（Thioglycollate，TG）诱导小鼠腹腔巨噬细胞的大量产生。
　　2.采用碘化丙锭（Propidium iodide，PI）染色法，测定GOS对巨噬细胞的细胞毒作用。
　　3.采用蛋白质免疫印迹法检测GOS对LPS刺激或未刺激的小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞中炎症小体通路相关蛋白质表达水平的影响。
　　4.采用流式微球捕获蛋白定量技术(Cytometric beads array,CBA)检测GOS对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β的蛋白水平的影响。
　　5.利用大肠杆菌DH5α活菌腹腔注射，建立小鼠细菌性败血症模型，检测GOS对细菌性败血症小鼠存活率的影响。
　　结果：
　　1. GOS能剂量依赖性和时间依赖性地引起经LPS激活或未刺激的小鼠腹腔巨噬细胞发生死亡，且低浓度（<5μM）时对细胞的毒性较低，高浓度（>5μM）时对细胞显示出较大的毒性。与ATP处理的细胞相似，GOS引起的细胞死亡伴随急剧细胞膜破裂和HMGB1及pro-caspase11的释放，提示该死亡是细胞焦亡。
　　2.GOS能诱导ASC缺失的RAW264.7细胞发生焦亡。
　　3.GOS能诱导大量HMGB1、pro-IL-1β及pro-caspase-11从LPS刺激的巨噬细胞释放到培养液中，但仅能诱导低水平的成熟IL-1β的分泌。
　　4.泛caspase和caspase-1亚家族抑制剂均能强烈地抑制焦亡的发生，但caspase-3抑制剂不能。非特异性细胞保护剂甘氨酸可以衰减GOS诱导的焦亡，而其他经典的焦亡抑制剂（包括氯化钾和N-乙酰半胱氨酸）可以抑制ATP诱导的焦亡，但对GOS诱导的焦亡不但没有抑制反而有增强作用。这些结果说明，GOS可能通过非经典炎症小体通路诱导巨噬细胞焦亡。
　　5.体内实验显示，GOS能清除TG引出的腹腔巨噬细胞，并大量募集其它的免疫细胞，加重小鼠细菌性败血症，显著降低细菌感染模型中小鼠的存活率。
　　结论：GOS在小鼠巨噬细胞中通过非经典炎症小体通路诱导细胞发生焦亡性死亡，提示其在体内对巨噬细胞有毒性作用。

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一、前 言

1.1 炎症小体

1.2 经典炎症小体通路

1.3 非经典炎症小体通路

1.4 细胞焦亡

1.5 棉酚的免疫药理活性

1.6 本研究课题的目的和意义

二、实验材料和实验方法

2.1 实验材料

2.2实验方法

三、实验结果

3.1 GOS诱导TG诱发的腹腔巨噬细胞发生焦亡性细胞死亡

3.2 GOS诱导RAW 264.7巨噬细胞发生焦亡性细胞死亡

3.3 泛caspase和caspase-1亚家族抑制剂能够抑制GOS诱导的细胞焦亡

3.4甘氨酸减弱GOS诱导的腹腔巨噬细胞发生焦亡

3.5 ROS清除剂加重RAW 264.7细胞中GOS诱导的细胞焦亡

3.6 GOS 清除体内的腹腔巨噬细胞并降低细菌性败血症模型中小鼠的存活率

四、讨 论

五、全文总结

参考文献

附录 英文缩略词

在校期间发表论文清单

致谢